糖蛋白是蛋白质翻译后修饰的产物，在正常和病理过程中发挥着关键作用，越来越多的证据表明蛋白质糖基化与癌症进展之间存在关键联系。基于化学和质谱的技术以及基于人工智能的平台的进步使得通过糖组学和糖蛋白质组学对癌症和聚糖和糖蛋白的器官特异性变化进行广泛的研究成为可能。目前大量的生物标志物发现工作集中在血液的血浆和血清上，很少有工作针对更易获得的流体类型（如尿液）进行生物标志物发现。尿液已被证明含有丰富的修饰蛋白，迄今为止已鉴定出超过2600种糖蛋白。鉴于尿液糖蛋白作为疾病生物标志物的潜力，需要开发改进的尿液糖蛋白质组学工作流程，以便更好的在生物流体中发现生物标志物。

今天为大家分享一篇2024年发表在Nature子刊Scientific Reports上的文章，文章的题目是“Identification and characterization of intact glycopeptides in human urine”。基于LC-MS/MS的完整糖肽分析方法，分析了人类尿液中的糖蛋白，完成了尿蛋白糖基化位点的鉴定和特定糖基化位点上糖链组成的表征。基因富集分析揭示了尿液糖蛋白组与尿液蛋白组在生物过程、细胞组分和分子功能上的差异，以及基于观察到的主要糖链类别的差异。对蛋白质上的糖基化异质性进行了检查，以确定给定蛋白质的多个位点上的糖基化变化，并提供了个别位点与整个蛋白质的糖基化趋势不同的具体示例。综合来看，这个数据对未来尿液糖蛋白质组学研究和发展提供了参考。

01 实验研究方法

这篇文章采用了基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的完整糖肽分析技术，对人类尿液中的糖蛋白进行了深入分析。研究团队通过优化的样品处理工作流程，结合了强阴离子交换和静电排斥亲水作用色谱（SAX-ERLIC）富集糖肽，以及BEH C18反相色谱进一步分离，然后利用高能C捕获解离（HCD）提高肽段碎裂效率，通过生物信息学分析，从而鉴定和表征了蛋白质的糖基化位点以及特定糖基化位点上的糖链结构，实现了对尿液糖蛋白质组的全面和高精度分析。

02 实验结果

1.糖肽的鉴定与表征：

研究中利用LC-MS/MS技术成功鉴定了45,303个高质量的完整N-糖肽，这些糖肽对应于347种独特的糖蛋白上的751个糖基化位点，揭示了尿液中糖蛋白的多样性和复杂性。

鉴定的总糖肽中约有50%对应于5种丰富的蛋白质。尿调节蛋白(UMOD)是尿中含量最多的蛋白，约占已鉴定总糖肽的28%。大约70%的糖蛋白被不止一种独特的糖肽识别。此外，44%的糖蛋白具有两个或更多独特的糖位。糖肽上的聚糖组成包括超过269种独特的结构。按聚糖基团分类，复杂岩藻糖化加唾液酸化是最丰富的类型。复杂未修饰、高甘露糖的、杂合型和其他结构的聚糖较少，占总聚糖的21.3%。

图2. 糖肽的鉴定与表征

2.糖蛋白质组与蛋白质组的比较分析：

通过基因富集分析，研究发现尿液糖蛋白质组在生物过程、细胞组分和分子功能方面与尿液蛋白质组存在显著差异，特别是在免疫反应和细胞生长/维护等生物过程中表现出更高的富集度。

图3.鉴定的尿糖蛋白与尿蛋白质组的基因富集分析

3.尿液糖蛋白优势聚糖类型分析：

由于复杂型岩藻糖和唾液酸化糖蛋白是尿糖蛋白组中最常见的聚糖类型，研究人员进行了基因富集分析，将这些糖蛋白与人类蛋白质组进行比较。我们观察到与免疫反应相关的蛋白质显著富集。细胞外、外泌体、质膜和溶酶体蛋白以及与受体活性相关的分子功能富集了复杂的岩藻糖化加唾液酸化糖蛋白。使用相同的方法，比较了复杂唾液化糖蛋白与所有人类蛋白质。再一次说明了有丰富的糖蛋白参与免疫反应。有趣的是，与复杂的唾液化糖蛋白加唾液化糖蛋白相比，复杂的唾液化蛋白在相似的细胞区室中富集，在细胞外、外泌体和溶酶体相关蛋白中富集。复合物唾液化蛋白在防御/免疫蛋白活性、蛋白酶抑制剂活性、信号肽和SERPIN结构域也显著富集。高甘露糖糖蛋白与所有人类蛋白质进行比较时，并未观察到分子功能相关的显著富集。

图4.显著性的糖蛋白基因富集分析

4.糖基化异质性：

研究观察到同一蛋白质上不同糖基化位点的糖链类型存在显著差异，这种现象表明了蛋白质上糖基化的高度异质性，对于理解蛋白质功能和疾病标志物的发现具有重要意义。

UMOD是尿液中含量最丰富的糖蛋白，结果鉴定了UMOD蛋白含12614个总糖肽，对应1485个独特型糖肽，包含269个独特的糖结构，映射到UMOD上的5个糖位，5个糖位点中鉴定的4个位点含量最高的聚糖均为复杂唾液化加岩藻糖化糖型。然而，N275表现出明显不同的模式，71%的糖肽鉴定含有高甘露糖结构。为了确定这个特定位点上糖基化的差异是否可能是由于氨基酸在三维空间上的位置造成的。研究发现，N275的残基深度比其他四种糖位点更大，这四种糖位点被映射到蛋白质上更多的溶剂可接近的区域。这些结果与先前的观察一致，即蛋白质结构决定了聚糖的形成。因此，N275上占主导地位的高甘露糖聚糖可能至少部分是由于该糖苷的可及性有限，因此限制了糖转移酶对该位点上的聚糖的可及性。

图5. UMOD糖基化异质性

03 结论

研究人员利用LC-MS/MS技术和生物信息学分析，在人类尿液中鉴定和表征了大量的糖蛋白和糖肽，揭示了尿液糖蛋白质组与尿液蛋白质组在生物过程和分子功能上的显著差异，并观察到了糖基化异质性，即同一蛋白质上不同糖基化位点的糖链组成存在显著差异，这些发现为理解糖蛋白在人体健康和疾病中的作用提供了新的视角，并为未来尿液糖蛋白质组学研究和疾病生物标志物的发现奠定了基础。