环状RNA（circRNA）是一种具有共价闭合环状结构的新型单链非编码RNA，通过非规范剪接或反向剪接事件产生圆形构象，在生物体细胞内极其稳定，是治疗人类疾病的热门靶点，具有广泛的应用潜力，特别是在生物医药领域开拓了全新的思路。在疫苗开发领域，环状RNA疫苗展现出其独特的优势，与线性mRNA相比，环状RNA由于其共价封闭的环结构而高度稳定，保护其免受外切酶介导的降解。研究表明，环状RNA疫苗可以在体内产生更高水平、更加持久的抗原，诱导机体产生的中和抗体比例更高，可以更有效地对抗病毒变异，降低疫苗潜在的抗体依赖增强症（ADE）副作用。

然而，环状RNA编码的新抗原在抗肿瘤免疫中的作用机制尚不清楚。2024年1月18日，中山大学宋尔卫/苏士成团队在《Nature》杂志发表题为“Tumour circular RNAs elicit anti-tumour immunity by encoding cryptic peptides”的研究成果，通过质谱分析人类乳腺癌样本的HLA类I（HLA-I）肽组，结合核糖体测序，鉴定了由肿瘤特异性环状RNA（circFAM53B）非典型翻译的HLA-I结合隐性抗原肽段。并进一步探讨了隐性肽段可有效地以抗原特异性的方式激活CD4+和CD8+ T细胞，并诱导抗肿瘤免疫。在临床上，circFAM53B及其编码肽段的表达与乳腺癌和黑色素瘤患者中抗原特异性CD8+ T细胞的大量浸润和更好的生存率相关，从机制上讲，circFAM53B编码的肽段对HLA-I和HLA-II分子都具有较强的结合亲和力。在体内，给携带乳腺癌或黑色素瘤的小鼠接种由肿瘤特异性circRNA或其编码肽段组成的疫苗，增强了肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞的浸润，从而有效控制了肿瘤。该研究表明利用肿瘤特异性circRNA进行疫苗接种可能作为对抗恶性肿瘤的一种免疫治疗策略。

首先，研究者使用HLA-I免疫沉淀技术从12例乳腺癌患者的肿瘤组织样本中捕获与HLA-I分子结合的肽段，进行质谱分析，得到的肽段与UniProt数据库、全外显子测序（WES）、RNA测序（RNA-seq）数据进行匹配，以寻找肿瘤特异性突变肽段，由于在编码基因组中未发现特异性肽段，研究者转向探索非编码区域，包括剪接变体、长非编码RNA（lncRNAs）、非翻译区（UTR）等，使用核糖体测序（Ribo-seq）数据来鉴定正在被翻译的circRNA，并通过与质谱数据的匹配来识别具有高免疫原性的肽段，在Ribo-seq数据中，研究者发现了与肿瘤特异性circRNA编码的且与HLA-I有强结合亲和力的肽段，并使用rRNA-depleted RNA-seq库搜索质谱数据和定量PCR（RT-qPCR）来验证这些circRNA的存在和表达，之后研究者评估了这些肽段的免疫原性以及免疫应答反应，并分析了大量临床样本，以评估circFAM53B表达与肿瘤特异性T细胞浸润和患者生存之间的关系。最后利用小鼠模型评估了肽段疫苗对肿瘤生长的影响。

为了筛查乳腺癌中潜在的TSAs，作者对取自6名具有不同HLA分型的乳腺癌患者的肿瘤组织样本进行HLA-I免疫沉淀，然后进行质谱(MS)分析。结果未发现任何肿瘤特异性突变多肽。为了鉴定从基因组的非编码区域中获得的HLA-I免疫肽组中的隐肽，将上述MS数据基于核糖体测序(Ribo-seq)数据的非规范开放阅读框(ORFs)数据库进行了匹配，识别了4个具有高免疫原性的HLA-I结合肽（表1），这些编码环状RNA也被rRNA-depleted RNA-seq库搜索鉴定，并通过逆转录定量PCR (RT-qPCR)确认(图1b)。circFAM53B(182-200) (ALFRLTNRA)或circFAM53B(210-218) (RTAHYGTGR) 的HLA-I肽段在三名乳腺癌患者中均存在，与HLA-I的亲和力比其他洗脱肽更强(图1d)。将其他的6个乳腺癌样本的质谱数据通过rRNA-depleted RNA-seq库搜索也鉴定到circFAM53B来源的多肽。

图1. 肿瘤特异性抗原肽的发现

表1. 6例乳腺癌患者的质谱鉴定后筛选的4条高免疫原性的抗原肽

研究者通过分析树突状细胞(DCs)的成熟及其转染circFAM53B后启动初始T细胞的能力，研究了circFAM53B在诱导免疫反应中的作用。将表达circFAM53B (circFAM53B+)的HLA-A*02+或HLA-A*11+的乳腺癌患者外周血中的树突状细胞进行circFAM53B或linFAM53B RNA电穿孔的体外转录(IVT)，采用自体circFAM53B+乳腺癌细胞再刺激后，通过IFNγ酶联免疫斑点(ELISpot) (图2a)和流式细胞术(图2b)检测，体外激发的CD4+和CD8+ T细胞产生的细胞因子、IFNγ、IL-2和TNF显著增加，此外，用转染circFAM53B的效应CD8+ T细胞体外培养的DC细胞能够识别和裂解自体circFAM53B+乳腺癌细胞(图2c)，但不能识别circFAM53B 敲除的乳腺癌细胞(图2d)。为了进一步探索circFAM53B在体内的免疫原性，将乳腺癌患者来源的异种移植物(PDXs)植入免疫低下的NOD/SCID小鼠，然后静脉注射自体DC细胞和T细胞，用circFAM53B RNA或linFAM53B RNA电穿孔灌注树突状细胞。与未转染或linFAM53B转染DCs的小鼠相比，接受circFAM53B转染DCs的小鼠肿瘤生长显著降低(图2e)，分离并纯化了肿瘤浸润淋巴细胞后体外用circFAM53B+肿瘤细胞再攻击后，circFAM53B转染的DCs的小鼠中，CD4+和CD8+ T细胞(图2g)和CTLs中穿孔素和GZMB(图2h)及IFNγ的产生显著增加，这一结果与抑制肿瘤生长相类似。

图2. circFAM53B诱导抗肿瘤免疫

为了进一步证实circFAM53B编码能力，将携带3×Flag-coding序列的修饰的P-circ表达载体转染HEK293T细胞。circFAM53B编码一个219个氨基酸的肽，以下简称为circFAM53B-219。该肽中的180个氨基酸序列(circFAM53B(1-180))对应线性mRNA翻译的123-302位氨基酸(linFAM53B(123-302))。然而，在ORF的跨越交界处有一个与linFAM53B-422不同的39个氨基酸的肽(circFAM53B(181-219))
(图3a)。为了研究这独特的肽是否由circFAM53B编码，生成了抗circFAM53B-219。抗体的Western blotting在转染了circFAM53B的HEK293T细胞中检测到24kda的特异条带，而在未转染的细胞和转染了linFAM53B的细胞中没有检测到。为了进一步探索circFAM53B编码的多肽的功能，使用circRNAdb数据库(reprod.njmu.edu.cn/cgi-bin/circRNAdb/circRNADb.php)32)获得了234个来自circFAM53B的HLAI型肽和2731个HLA-II型肽，使用IEDB和SYFPEITHI数据库，分别筛选出诱导 T细胞应答的作用较强的circFAM53B(192-200)和circFAM53B(190-204)，将合成的circFAM53B(181-219)和linFAM53B编码的linFAM53B(264-302)加载到HLA-A*02+乳腺癌患者的DC细胞中，并用自体naive T细胞培养。发现circFAM53B(192-200) (ALFRLTNRA)在HLA-A*02+供体中诱导CD8+ T细胞应答的作用较强，与公认的乳腺癌抗原肽HLA-A*02-限制性人MUC1(LLLLTVLTV)相当(图3b)，通过HLA稳定试验(图3c)和采用生物层干涉法检测重组circFAM53B(192-200)与HLA-A2的相互作用(图3d)验证了肽结合HLA分子的亲和力，决定了其抗原诱导的免疫反应，在circFAM53B(181-219)肽脉冲或circFAM53B RNA转染DC后检测到circFAM53B(192-200)肽的circFAM53B特异性五聚体(图3)，验证了circFAM53B(192-200)诱导抗原特异性T细胞应答。

图3. circFAM53B编码抗原肽

为了确定我们的发现是否具有临床相关性，研究者采用938例原始侵袭乳腺癌患者的冷冻肿瘤组织进行RT-qPCR分析，355例石蜡包封肿瘤组织进行IHC分析，212例乳腺癌样本进行ISH分析，以及29例正常乳腺组织作为对照，测量了人类乳腺癌样本中circFAM53B的RNA和蛋白水平，结果表明乳腺肿瘤组织中发现circFAM53B-219表达丰富，乳腺癌组织中circFAM53B-219肽段的表达水平与其circRNA表达呈正相关，以及检测到肿瘤浸润circFAM53B产生特异性CTLS，这些发现均表明，circFAM53B-219在乳腺癌中的表达与增强的适应性抗肿瘤免疫和更好的癌症预后有关。

图4.circFAM53B与预后相关

接下来，作者通过使用不同MHC背景的小鼠黑色素瘤模型和小鼠乳腺癌模型研究了circRNA的免疫功能在动物模型中是否有效。脂质体包裹的circFAM53B(在体外呈环状)或线性的Fam53b (linFAM53B) RNA免疫C57BL/6小鼠，接种了circFAM53B RNA的小鼠脾T细胞在体外与转染了circFAM53B的骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)接触后释放了大量的IFNγ，而接种了linFAM53B的小鼠的T细胞没有反应(图5a)，circFAM53B转染的BMDCs的攻击显著增加了小鼠CD4+和CD8+ T细胞及细胞因子的产生(图5b)。此外，通过体外细胞毒性试验(图5c)和乳酸脱氢酶(LDH)释放试验，circFAM53B RNA接种小鼠的CD8+ T细胞对B16F10表现出较强的细胞溶解活性。

图5.环状RNA在小鼠中引发的免疫反应

为了进一步评估circRNA来源的多肽疫苗的治疗潜力，分别用circFAM53B(181-203)和circGigyf2(82-104)免疫带有同基因B16F10黑色素瘤的C57BL/6小鼠和带有4T1乳腺癌的BALB/c小鼠，采用肽疫苗接种的策略(图6)。与单独接受佐剂poly(I:C)或相应的linFAM53B(281-303)多肽疫苗的小鼠相比，circFAM53B野生型(WT)肿瘤在接种circFAM53B(181-203)小鼠中的生长显著受到抑制(图6)。

图6.疫苗可以显著抑制肿瘤生长

本研究通过质谱(MS)分析鉴定到circRNA来源的4个具有高免疫原性的HLA-I结合肽，探索了自然形成的环状RNA可以通过非典型翻译隐抗原肽，并且具有高度免疫原性。强调了肿瘤特异性环状RNA能够在启动肿瘤抗原特异性T细胞引发抗肿瘤免疫反应，从而增强抗肿瘤免疫反应。

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