人类白细胞抗原 （HLA）呈递肽的T细胞识别在恶性疾病的免疫监视中起关键作用，各种基于T细胞的免疫治疗方法旨在利用相应的肿瘤抗原在治疗上诱导抗肿瘤T细胞反应。因此，鉴定肿瘤细胞表面的高频率、肿瘤特异性、免疫系统可识别的抗原靶标是这些治疗方法成功的核心。肿瘤抗原的确定通常离不开良性组织免疫肽组学的参考，然而，良性组织来源的HLA配体的参考数据库的可用性仍然有限。基于质谱 （MS） 的免疫肽组学是识别和表征细胞表面天然存在的HLA I类和HLA II类限制性肽的有效方法，尽管该方法在过去几十年中取得了巨大的技术进步，但基于MS鉴定HLA呈递肽受到低丰度的阻碍，到目前为止仍无法捕获整个免疫肽组。

T细胞识别人类白细胞抗原 (HLA) 呈递的肿瘤相关肽是癌症免疫监测的核心。基于质谱(MS)的免疫肽组学是直接鉴定和表征天然存在的肿瘤相关肽的唯一无偏倚方法，这是开发基于T细胞的免疫疗法的关键先决条件。2023年，在Nature Communications发表了题为“TOFIMS mass spectrometry-based immunopeptidomics refines tumor antigen identification”的文章，报告了基于离子淌度分离的飞行时间（TOFIMS）的MS方法用于下一代免疫肽组学，能够高速、灵敏地检测 HLA 呈递的肽。应用 TOFIMS方法生成了由 94 个实体组织和血液学来源的良性样本的免疫肽组学的数据集，扩展了良性参考免疫肽组数据库>150000个HLA呈递肽段，并鉴定了高频出现的自身抗原和尚未描述的肿瘤抗原，这些抗原包含低丰度突变衍生的新表位，可能作为未来癌症免疫疗法开发的靶点。

研究方法

研究样本均为病人离世后72小时内收集的良性实体组织样本和血液样品，并由认证病理学家注释，随后在液氮中快速冷冻并储存在-80°C，用于分离外周血单个核细胞（PBMCs），使用EBV转化的人类B细胞系JY（表达HLA-A*02，HLA-B*07，HLA-C*07），在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养。之后使用特定的单克隆抗体免疫分离HLA I和HLA II分子呈递的肽段。使用Bruker的timsTOF Pro设备，结合了离子淌度（TIMS）和平行积累-串联碎片化（PASEF）技术，以及时间飞行（TOF）质谱仪获取TOFIMS质谱数据，使用Thermo Fisher Scientific的Ultimate 3000 RSLC Nano UHPLC系统进行肽段分离获取Orbitrap质谱数据，对质谱数据，使用PEAKS® Studio软件搜索人类UniProt（20385个条目）数据库，酶特异性设置为无，质量误差容忍度为5 ppm（Orbitrap MS数据）或20 ppm（TOFIMS数据），碎片离子为0.02 Da。对用于免疫肽组学分析的同一快冻肿瘤组织进行测序，以识别肿瘤特异性突变。

研究结果

1. 离子淌度质谱（IMS MS）能够大规模鉴定天然 HLA 呈递的肽

通过优化液相色谱（LC）工作流程和质谱参数，实现了对HLA呈递肽段的高灵敏度和高速检测。包括了对不同的梯度类型和长度进行评估，以及对MS参数（如Ramp time, Pre pulse storage等）的优化，如图1所示。

2. 使用TOFIMS质谱在良性组织免疫肽组学的应用

使用 TOFIMS MS的免疫肽组学方法，研究者能够从94个原发性良性样本中生成了一个包含超过150000个HLA呈递肽段的新的大型良性TOFIMS数据集。这一数据集显著扩展了良性参考免疫肽组数据库，证明了TOFIMS技术在大规模鉴定HLA呈递肽方面的有效性，如图2所示。

3. TOFIMS数据集显著扩展了现有的关于良性组织中HLA呈递肽段的参考数据库

研究者们对94个原发性良性样本生成的TOFIMS数据集和已有的Immune Epitope Database (IEDB)和Orbitrap技术获得的数据进行比较，发现TOFIMS数据集中有46%的HLA I型和54%的HLA II型呈递肽段是之前未被描述的，并通过GRAVY（Grand Average of Hydropathy）评分发现与已发表的良性相关肽段相比，TOFIMS独家肽段的GRAVY评分更高，显示出更高的疏水性；而通过预测的免疫原性分析表明，TOFIMS独家肽段的免疫原性高于之前描述的良性肽段；与已发表的良性相关肽段在氨基酸组成对比后发现，二者没有显著差异，且在KEGG通路和亚细胞位置的相对丰度上也没有显著差异，表明这些新鉴定的肽段具有与已知肽段相似的生物学特性，如图3所示。

4.TOFIMS免疫肽数据集有助于肿瘤新抗原的鉴定

研究者们利用TOFIMS数据集与已发表的肿瘤相关抗原（TAA）进行比较，识别出真正肿瘤特异性的抗原，并排除了之前被认为是肿瘤特异性的抗原，但有相当一部分在良性组织中也有表达的抗原，减少了免疫疗法的副作用，从而优化免疫疗法的靶点选择。应用TOFIMS数据集，作者识别出在特定类型的肿瘤（如慢性淋巴细胞性白血病，CLL）中广泛表达的、之前未被描述的HLA I和II类肽段，这些肽段在CLL样本中表现出高频率的表达，并且可能在多个CLL患者中具有广泛的适用性，并在临床上与已知的良性组织HLA肽段数据库比较，能够将CLL患者特有的肽段与良性组织中的肽段区分开来，有助于识别出真正具有免疫原性的肿瘤特异性肽段。研究者还利用TOFIMS技术，鉴定了新的非突变肿瘤特异性肽段抗原，这些抗原在良性组织中未被检测到，但在肿瘤样本中特异性表达，且这些新表位在传统方法中可能难以检测到，为免疫疗法提供了新的靶点，如图4所示。

结论

本研究成功开发了基于时间飞行质谱（TOFIMS）的免疫肽组学方法，用于扩展良性免疫肽组数据库并改进肿瘤相关抗原（TAA）的发现，并提供了超150000个的HLAI类和II类呈递肽段的TOFIMS数据集，利用该数据集能够重新评估和精细化识别多个肿瘤实体中的TAA，排除了之前被认为是肿瘤特异性但实际上在良性组织中也有表达的抗原，此外，本文还鉴定出新的、高频的非突变肿瘤特异性肽段抗原，以及由肿瘤特异性突变衍生的新表位，这些为T细胞免疫疗法提供了潜在的新靶点。