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干货分享丨免疫原性新抗原的鉴定、预测和验证

来源:百小蓁发布时间:2024-06-18浏览量:428

新抗原的鉴定是开发有效免疫疗法的关键步骤。目前,基于全基因组测序(WES)、RNA-seq和TCGA蛋白组学数据的融合,可以在整个癌症谱中筛选新抗原。然而,鉴于肿瘤类型、肿瘤病变和患者的广泛差异,定制的免疫治疗需要基于不同的患者和肿瘤特征鉴定和预测新抗原。预测免疫原性需要鉴定基因的突变以及患者MHC分型的详细信息,因为肿瘤新抗原对突变免疫反应的顺序刺激取决于几个变量:肽段的翻译和加工、MHC分子对突变肽的呈递以及pMHC复合物与TCRs的亲和力。鉴定新抗原表位有两种主要策略:①免疫基因组学方法:基于NGS的计算机方法创建虚拟肽组;②免疫肽组学方法:使用MS分析MHC结合肽段。




体细胞突变的鉴定

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通过使用NGS比较肿瘤和正常组织之间的遗传变化,大大加快了免疫基因组策略。目前,从NGS数据中检测可能的新抗原的初始阶段是使用肿瘤和正常DNA的WES绘制肿瘤特异性遗传异常。RNA-seq数据可以与WES结合以确定突变基因是否在肿瘤中表达。此外,在RNA-seq中可以发现更多隐藏的生物信息,如拷贝数变化、微生物污染、转座元件、细胞类型和新抗原的存在等。RNA-seq也可用于检测选择性剪接事件和估计突变等位基因表达的相对频率。通过使用配对测序等检测染色体重排的方法,可能会大大提高基于NGS的TMB测量的预测值。最近的研究表明,当假定存在无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)时,具有移码突变和非典型剪接模式的转录物会产生抗原肽。为了完全鉴定由移码突变和异常异构体产生的新抗原,需要来自全长转录物结构的精确肽序列。使用纳米孔测序技术,全长转录组测序的准确率可达90%,为当前的RNA-seq提供互补信息,以鉴定等位基因特异性转录和剪接。
根据癌症基因组数据,免疫基因组学技术预测了数百万种可能的突变衍生的新抗原,但其中绝大多数没有在HLA-结合肽的蛋白质组分析中表现出来。通过质谱技术可以高通量鉴定免疫沉淀和提取的MHC结合肽,并且将样品的串联质谱与合成肽的串联质谱进行对比,可以验证免疫基因组方法预测的新抗原。除了验证由异常DNA序列或RNA表达引起的新抗原外,基于MS的蛋白质组学为蛋白质水平的新抗原检测提供了“金标准”,这在DNA和RNA研究中是无法发现的。例如,MS可用于检测在细胞转化过程中异常翻译后修饰产生的新抗原。此外,MS还与NGS联合,以进一步检测由体细胞突变、非编码RNA和蛋白酶体剪接产生的肿瘤特异性新抗原,而基于全外显子组或转录组的测序技术忽略了这一点。为了在蛋白质水平上更深入地了解新抗原,应创建更方便用户和实用的工具,整合基因组、转录组和蛋白质组数据,用于免疫肽组学的新抗原检测。





计算机新抗原预测

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基于NGS数据,已经创建了虚拟肽组,并通过计算机方法发现了潜在的新抗原。简言之,新抗原预测的典型工作流程可以总结为以下步骤:①突变调用;②HLA分型;③基于HLA结合亲和力的新抗原筛选和优先排序;④使用基于T细胞的分析对免疫原性新抗原进行实验验证(图1)。

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1.新抗原预测的计算机工作流





HLA分型

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新抗原通常以细胞特异性的方式由CD8+T细胞的MHC-I和CD4+T细胞中的MHC-II呈现,与其他抗原非常相似。人类有24000多个不同的HLA-I(HLA-A、-B和-C)和HLA-II(HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP)等位基因,它们的混合导致了多态性的多样性。患者的HLA等位基因决定了他们的肿瘤特异性新抗原库,这些库将用于T细胞识别。因此,新抗原预测中最重要的初始步骤之一是确定患者的HLA基因型。
可以将几种计算方法应用于NGS数据来进行HLA分型。大多数方法依赖于从WES或WGS获得的DNA衍生的NGS数据。例如,Optitype和Polysolver是用于鉴定I类HLA等位基因的良好工具;LOHHLA是准确测量等位基因特异性HLA拷贝数生物信息学工具;HISAT基因型、ATHLATES、HLA-HD可用于I类和II类分型。RNA-seq数据也可由arcasHLA、seq2HLA和HLAProfiler等工具对HLA等位基因进行分型。





突变和变异调用

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通过比较来自同一患者的肿瘤和正常组织的NGS数据,可以预测由体细胞突变引起的突变肽。WES是新抗原预测的推荐NGS数据来源,因为它通过关注基因组的蛋白质编码区域提供了最高的突变覆盖率。计算分析包括数据预处理和质量控制、调用体细胞突变的变体,以及利用公共基因组、转录组和蛋白质组序列数据库预测改变的蛋白质和功能影响。对于各种新抗原来源,已经开发了各种综合技术用于新抗原鉴定和优先排序。根据筛选假定新抗原的策略,这些技术可分为两组:基于逐步分析的过滤策略和基于综合评分系统的过滤策略。高效的一站式工具可以将WES/WGS和RNA-seq数据作为输入,并基于选定的指标执行一系列过滤步骤,如肽和MHC分子的结合亲和力、序列覆盖率、变异等位基因频率和基因表达,以去除假阳性并生成潜在新抗原列表。





HLA结合和新抗原呈递的预测

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多种计算机预测工具可用于基于MHC分子处理和呈递的新抗原的计算机发现,包括NetChop、NetCTL和NetCTLpan2,通过将HLA配体数据纳入机器学习算法,如线性回归和人工神经网络,可以积极提高预测能力。

NetMHCpan和MHCflurry使用体外肽HLA结合数据集用于训练机器学习模型,这是当前HLA配体识别的主要组成部分。值得注意的是,NetMHCpan通过将结合亲和力数据中的信息与MS肽组数据相结合,为MHC-I等位基因提供“泛特异性”机器学习策略,从而提高了肿瘤新抗原的预测性能。
越来越多的证据证明了MHC-II新抗原在抗肿瘤免疫反应中的重要性。然而,与MHC-I分子相比,MHC-II肽结合亲和力的计算预测目前不太精确。首先,与MHC-I分子相比,MHC-II结合肽在肽长度和结合序列基序方面更复杂。其次,MHC-II分子中α和β链的多态性也大大扩展了肽结合特异性的多样性。最近,基于转录组和MS数据的计算方法已经开发出来。MARIA训练的深度学习模型将测序数据与天然存在的MHC-II配体结合在一起,当与已知的MHC-Ⅱ配体进行交叉验证时,该模型被证明优于淋巴瘤数据集中最广泛使用的预测因子NetMHCIIpan3.1。然而,有必要使用重要的数据集进行更多的研究,以证明其稳健性和有效性。
由于新抗原递呈受多种因素影响,单独预测结合亲和力不能准确反映细胞处理和CD8+T细胞反应。蛋白酶体剪接、肽进入内质网的运输、HLA等位基因,肽和MHC分子之间的结合亲和力等多种因素也需要被综合考虑进去。





候选新抗原免疫原性的评价与验证

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免疫原性新抗原必须满足两个或多个要求,主要瓶颈是MHC分子呈递和有效的TCR应答。根据最近的研究,大多数通过MHC分子呈递预测的新抗原不会引发免疫反应。因此,在评估潜在新抗原的免疫原性时,考虑pMHC复合物的TCR识别至关重要。
为了更准确地评估新抗原在免疫疗法中的可能应用,对其T细胞反应性的实验验证至关重要。新抗原反应性T细胞已通过基于T细胞的测定、多色标记的MHC四聚体、酶联免疫吸附点(ELISpot)和T细胞库分析进行验证或筛选。
一、T细胞检测
T细胞免疫原性检测是评价候选新抗原免疫原性最直接的方法。肽刺激后,通过流式细胞术测量 T 细胞活化标志物 4-1BB 和 OX-40 以及 ELISpot 测定中的 IFN 产生来测量体外扩增的新抗原特异性 T 细胞反应性。
二、MHC 四聚体技术
该技术由 4 个 MHC-抗原肽单体分子及荧光染料组成的复合物,它以带有信号标记的链霉亲合素为基础,交联四个 MHC 分子单体,形成 MHC 四聚体。一个 MHC 四聚体分子可与同一 T 细胞表面的 3-4 个 TCR 相识别并结合,从而大大增强了 MHC-抗原肽复合物与 TCR 之间的结合力和检测特异性,并可通过流式细胞术成功实现对抗原特异性的 T 细胞的离体分析。
三、酶联免疫斑点实验(ELIspot)
ELISPOT技术原理:用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子,并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
四、T细胞库分析
TCR库是体内TCR集合,也被认为是对于抗原特异性评价T细胞反应的新指标。随着单细胞分析技术的进步,越来越多的高通量T细胞测序方法被开发出来。如将单细胞RNA测序(scRNA-seq)与TCR测序相结合可提高检测的灵敏度;酵母展示的pMHC文库可用于发现新抗原特异性TCRs。
另外,计算机技术中有许多方法可以预测新抗原特异性T细胞识别。最常用的方法是NetCTL/NetCTLspan,它通过结合MHC结合、C端切割亲和力和TAP转运蛋白来生成综合评分,而不是直接预测T细胞结合。最近的研究使用机器学习或深度学习技术来预测TCR-肽/-pMHC结合。百蓁生物提出了一种用于免疫原性预测的个性化模型:DeepSelf,基于T细胞的中心耐受性,以个性化DeepNovo算法为核心,综合考虑了肽段与MHC的结合亲和力及与T细胞的应答反应,优化了新抗原的准确预测并减少了假阳性。



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免疫原性新抗原及其同源TCR的精确鉴定是个性化癌症免疫疗法中最关键和耗时的步骤。可以通过免疫基因组学方法和免疫肽组学方法来鉴定新抗原,免疫基因组学法使用基于NGS数据的计算机算法构建虚拟肽组,免疫肽组法使用MS分析MHC-结合肽。基因组和转录组测序数据也与HLA结合肽段的MS图谱相结合,以提高新抗原鉴定的敏感性和特异性。目前,由于成本较低的高通量测序和强大的深度学习算法的应用,基于新抗原的治疗成本可大大降低。高效的计算方法还可以使用巨大的数据队列来确定新抗原作为生存预后或ICB反应预测的生物标志物的潜力。最关键的是,这些表位预测的准确性还应通过早期临床研究中的免疫反应来确认,以促进基于新抗原的癌症疗法的发展。

参考文献:

Xie, Na, Guobo Shen, Wei Gao, Zhao Huang, Canhua Huang, and Li Fu. "Neoantigens: promising targets for cancer therapy." Signal transduction and targeted therapy 8, no. 1 (2023): 9.

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