通过使用NGS比较肿瘤和正常组织之间的遗传变化，大大加快了免疫基因组策略。目前，从NGS数据中检测可能的新抗原的初始阶段是使用肿瘤和正常DNA的WES绘制肿瘤特异性遗传异常。RNA-seq数据可以与WES结合以确定突变基因是否在肿瘤中表达。此外，在RNA-seq中可以发现更多隐藏的生物信息，如拷贝数变化、微生物污染、转座元件、细胞类型和新抗原的存在等。RNA-seq也可用于检测选择性剪接事件和估计突变等位基因表达的相对频率。通过使用配对测序等检测染色体重排的方法，可能会大大提高基于NGS的TMB测量的预测值。最近的研究表明，当假定存在无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）时，具有移码突变和非典型剪接模式的转录物会产生抗原肽。为了完全鉴定由移码突变和异常异构体产生的新抗原，需要来自全长转录物结构的精确肽序列。使用纳米孔测序技术，全长转录组测序的准确率可达90%，为当前的RNA-seq提供互补信息，以鉴定等位基因特异性转录和剪接。
根据癌症基因组数据，免疫基因组学技术预测了数百万种可能的突变衍生的新抗原，但其中绝大多数没有在HLA-结合肽的蛋白质组分析中表现出来。通过质谱技术可以高通量鉴定免疫沉淀和提取的MHC结合肽，并且将样品的串联质谱与合成肽的串联质谱进行对比，可以验证免疫基因组方法预测的新抗原。除了验证由异常DNA序列或RNA表达引起的新抗原外，基于MS的蛋白质组学为蛋白质水平的新抗原检测提供了“金标准”，这在DNA和RNA研究中是无法发现的。例如，MS可用于检测在细胞转化过程中异常翻译后修饰产生的新抗原。此外，MS还与NGS联合，以进一步检测由体细胞突变、非编码RNA和蛋白酶体剪接产生的肿瘤特异性新抗原，而基于全外显子组或转录组的测序技术忽略了这一点。为了在蛋白质水平上更深入地了解新抗原，应创建更方便用户和实用的工具，整合基因组、转录组和蛋白质组数据，用于免疫肽组学的新抗原检测。

基于NGS数据，已经创建了虚拟肽组，并通过计算机方法发现了潜在的新抗原。简言之，新抗原预测的典型工作流程可以总结为以下步骤：①突变调用；②HLA分型；③基于HLA结合亲和力的新抗原筛选和优先排序；④使用基于T细胞的分析对免疫原性新抗原进行实验验证（图1）。

图1.新抗原预测的计算机工作流

通过比较来自同一患者的肿瘤和正常组织的NGS数据，可以预测由体细胞突变引起的突变肽。WES是新抗原预测的推荐NGS数据来源，因为它通过关注基因组的蛋白质编码区域提供了最高的突变覆盖率。计算分析包括数据预处理和质量控制、调用体细胞突变的变体，以及利用公共基因组、转录组和蛋白质组序列数据库预测改变的蛋白质和功能影响。对于各种新抗原来源，已经开发了各种综合技术用于新抗原鉴定和优先排序。根据筛选假定新抗原的策略，这些技术可分为两组：基于逐步分析的过滤策略和基于综合评分系统的过滤策略。高效的一站式工具可以将WES/WGS和RNA-seq数据作为输入，并基于选定的指标执行一系列过滤步骤，如肽和MHC分子的结合亲和力、序列覆盖率、变异等位基因频率和基因表达，以去除假阳性并生成潜在新抗原列表。

免疫原性新抗原必须满足两个或多个要求，主要瓶颈是MHC分子呈递和有效的TCR应答。根据最近的研究，大多数通过MHC分子呈递预测的新抗原不会引发免疫反应。因此，在评估潜在新抗原的免疫原性时，考虑pMHC复合物的TCR识别至关重要。
为了更准确地评估新抗原在免疫疗法中的可能应用，对其T细胞反应性的实验验证至关重要。新抗原反应性T细胞已通过基于T细胞的测定、多色标记的MHC四聚体、酶联免疫吸附点（ELISpot）和T细胞库分析进行验证或筛选。
一、T细胞检测
T细胞免疫原性检测是评价候选新抗原免疫原性最直接的方法。肽刺激后，通过流式细胞术测量 T 细胞活化标志物 4-1BB 和 OX-40 以及 ELISpot 测定中的 IFN 产生来测量体外扩增的新抗原特异性 T 细胞反应性。
二、MHC 四聚体技术
该技术由 4 个 MHC-抗原肽单体分子及荧光染料组成的复合物，它以带有信号标记的链霉亲合素为基础，交联四个 MHC 分子单体，形成 MHC 四聚体。一个 MHC 四聚体分子可与同一 T 细胞表面的 3-4 个 TCR 相识别并结合，从而大大增强了 MHC-抗原肽复合物与 TCR 之间的结合力和检测特异性，并可通过流式细胞术成功实现对抗原特异性的 T 细胞的离体分析。
三、酶联免疫斑点实验(ELIspot)
ELISPOT技术原理：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
四、T细胞库分析
TCR库是体内TCR集合，也被认为是对于抗原特异性评价T细胞反应的新指标。随着单细胞分析技术的进步，越来越多的高通量T细胞测序方法被开发出来。如将单细胞RNA测序(scRNA-seq)与TCR测序相结合可提高检测的灵敏度；酵母展示的pMHC文库可用于发现新抗原特异性TCRs。
另外，计算机技术中有许多方法可以预测新抗原特异性T细胞识别。最常用的方法是NetCTL/NetCTLspan，它通过结合MHC结合、C端切割亲和力和TAP转运蛋白来生成综合评分，而不是直接预测T细胞结合。最近的研究使用机器学习或深度学习技术来预测TCR-肽/-pMHC结合。百蓁生物提出了一种用于免疫原性预测的个性化模型：DeepSelf，基于T细胞的中心耐受性，以个性化DeepNovo算法为核心，综合考虑了肽段与MHC的结合亲和力及与T细胞的应答反应，优化了新抗原的准确预测并减少了假阳性。

参考文献：

Xie, Na, Guobo Shen, Wei Gao, Zhao Huang, Canhua Huang, and Li Fu. "Neoantigens: promising targets for cancer therapy." Signal transduction and targeted therapy 8, no. 1 (2023): 9.