摘要

糖基化对生物药品的药效、半衰期及抗原性等具有重要影响，由于多因素相互作用使得各生产批次糖型几乎不可能相同，抗体分子糖型的异质性是生物制药产业一个明显的挑战。使用质谱对糖肽进行分析已被证明其可作为生物药品表征的有效工具。在本研究中，我们提出了一种利用专利富集材料，采用多酶联合酶解技术，使用LC-MS/MS结合不同碎裂方法进行完整糖肽采集，并使用PEAKS®️ GlycanFinder软件进行糖肽数据分析的糖基化全景表征技术流程。利用本流程对Etanercept的N-和O-糖基化表征，发现11个新的O-糖基化位点，实现目前对Etanercept最全面的糖基化表征。

背景介绍

蛋白质糖基化是最常见和最复杂的翻译后修饰（PTMs）之一，在蛋白质的折叠、稳定性、定位、功能和相互作用中起着关键作用[1]。重组糖蛋白在不同宿主细胞系中的表达会产生不同的糖型，从而改变蛋白质的性质和功能[2]。因此，全面了解蛋白质结构和翻译后修饰对于确保质量、安全性和有效性至关重要。在这里，我们使用PEAKS®️ GlycanFinder软件分析 Etanercept中N-和O-糖基化位点和丰度的差异。

方法

将提取好的Etanercept纯蛋白样本置于溶液或SDS-PAGE胶中使其变性、还原与烷基化。为了获得更多的糖肽质谱信号以及增加糖肽鉴定深度，我们使用多种对糖基化位点特异的蛋白酶（如胰蛋白酶或其它蛋白酶）对蛋白进行酶解，以获得合适长度的糖肽。对于O-糖基化表征，我们首先使用PNGF去除N-糖基化修饰，再进行O糖酶和其它蛋白酶进行多酶联合酶切。蛋白经过酶解和脱盐后使用专利富集材料对糖肽进行富集以及LC-MS检测。选择HCD或CID进行N-糖基化表征，选择ETHCD进行O-糖基化鉴定。质谱下机数据使用PEAKS®️ GlycanFinder软件进行分析并出具服务报告。

结果和讨论

在本研究中，我们利用PEAKS®️ GlycanFinder软件分析了Etanercept 3个N-糖基化位点（Asn-149、Asn-171和Asn-317）上的聚糖结构（图1）。结果表明，每个N-糖基化位点都能鉴定到丰富的糖型分布。

图1. Etanercept 3个N糖基化化位点(Asn-149, Asn-171, and Asn-317)鉴定到的top 糖型结构及其丰度占比

随后，我们比较了相同位点不同重复间糖肽鉴定的准确度。图2条形图显示了在3次独立的LC-MS/MS数据中，在Etanercept N317位点检测到的所有糖链的定量信息。结果表明，N317位点上的糖链3次重复定量一致性较好，且与先前的报道一致[3]。

图 2. Etanercept N317在3次独立的LC-MS/MS数据中的糖链定量信息

在质谱检测与分析过程中，使用ETHCD质谱数据采集结合PEAKS GlycanFinder软件分析能够在每个糖基化位点获得确定的b/y带糖碎片离子谱图，同时人工手动检查和注释氧鎓离子、肽骨架的断裂和聚糖结构的片段进一步提高了糖肽鉴定的准确度（图3）。

图3 糖基化位点的碎片离子谱图

使用上述方法，我们除了鉴定到了之前报道的Etanercept 3个N-糖基化位点和11个O-糖基化位点，还鉴定到了11个新的O-糖基化位点（图4）。总之，我们的结果表明该流程能够对Etanercept的N-/O- 糖基化位点和丰度进行准确且深度的表征。

图4 Etanercept N/O 糖基化位点及对应糖型汇总图

参考文献:

[1] Eichler J. Protein glycosylation. Curr Biol. 2019 Apr 1;29(7):R229-R231.

[2] Swiech K, de Freitas MC, Covas DT, et al. Recombinant glycoprotein production in human cell lines. Methods Mol Biol. 2015;1258:223-40.

[3] Montacir O, Montacir H, Springer A, et al. Physicochemical Characterization, Glycosylation Pattern and Biosimilarity Assessment of the Fusion Protein Etanercept. Protein J. 2018 Apr;37(2):164-179.

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