严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)的出现，引发了全球大流行。2020年12月，FDA在美国发布了第一份预防COVID-19疫苗 (辉瑞-生物科技)的紧急使用授权，该疫苗是使用野生型SARS-CoV-2 (WT) 的刺突蛋白(S)蛋白设计的，然而自最初的SARS-CoV-2被发现以来，出现了许多变异体(VOCs)，在这些变异体中，五个变异体(B.1.1.7 (Alpha)、B.1.351 (Beta)、P.1 (Gamma)、B.1.617.2 (Delta)、B.1.1.529 (Omicron))是最值得关注的，明确这些病毒S蛋白的关键突变将有助于了解传播能力增强和免疫逃逸的机制。

不久前，美国国立卫生研究院疫苗研究所在Scientific reports上发表了题为“Site specific N‑ and O‑glycosylation mapping of the spike proteins of SARS‑CoV‑2 variants of concern”的文章，比较了野生型SARS‑CoV‑2菌株(WT)和五个突变体Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron的S蛋白上位点特异性糖基化和总体糖谱，结果发现，突变体上的S蛋白上的N-糖基化位点和O-糖基化位点都高度保守，尤其是受体结合域 (RBD) 上的位点。虽然位点保守，但观察到这些变体的N-糖基化和O-糖基化糖谱有显著变化。对中和抗体和疫苗表现出更高抗性的突变体中显示出岩藻糖化和唾液酸化的复杂型聚糖的总体丰度降低，而高甘露糖型聚糖在各个位点的丰度增加。对所有突变体中的S蛋白的糖基化位点和糖型谱的研究，将有助于理解病毒是如何变异而避开宿主免疫系统的。

研究方法

为了了解SARS-CoV-2变异体的传染性和病毒力的变化是否与S蛋白糖基化相关，作者对来自WT的S蛋白以及变异体 B.1.1.7 (Alpha)、B.1.351 (Beta)、P.1 (Gamma)、B.1.617.2 (Delta)和B.1.1.529 (Omicron)进行了N-糖和O-糖的定性定量分析。研究者利用HEK293细胞，获得了表达的重组S蛋白，采用多种蛋白酶消化，酶解产物利用串联质谱，采集的数据通过糖肽分析，确定了每个变异体S蛋白上的糖基化位点和糖型，并提取每个糖肽的MS1峰面积，对每个变体S蛋白上各位点的糖型进行了量化。

研究结果

1.各变异体的S蛋白上N-和O-糖基化位点高度保守

作者对VOCs上N-糖基化位点的对比显示，除了Delta变体上缺少N17位点和Gamma变体上出现了一个新的N20位点外，其他变异体上22个N-糖基化位点都是保守的 (图1)。

图1 .WT和VOCs的上各位点的聚糖分析

2. 各变异体S蛋白的糖基化位点以及N-糖和O-糖糖型

SARS CoV 2的Alpha (B.1.1.7)变体中，检测到了22个N-糖基化位点和T323 O糖基化位点。N122、N717和N1098位点的唾液酸增加，而N74、N165、N282、N616和N709位点的唾液酸减少；甘露糖结构在N61、N234、N709和N801位点升高，在N1098位点降低；N61、N709、N801、N1074位点的岩藻糖化降低，而在α变异体中只有N717位点的岩藻糖化增加(图1、2、3)。在Alpha变体中，T323的o -糖基化主要表现为core-1聚糖，而WT同时包含core-1和core-2聚糖(图2)。

SARS CoV 2的Beta (B.1.351)变体中，位点特异性糖基化比较显示，与WT相比，β变异体的N603和N801位点的唾液酸增加，而N165、N282、N331、N709和N1074位点的唾液酸减少；N61、N234、N343、N709、N717、N801和N1074位点的甘露糖含量均有所增加；N61、N74、N122、N657、N709、N717、N801、N1074和N1098位点的岩藻糖化也显示增加(图1、2、3)。相对于WT，Beta的T323位点只存在核心-1的O-聚糖且含量变少(图2)。

图2 . WT和VOCs中SARS-CoV-2刺突蛋白上的N-和O-聚糖位点特异性及糖型分布

图3. WT和VOCs各位点四种糖型的相对定量分析

SARS CoV 2的Gamma (P.1)变体发生了突变，T20N(将苏氨酸替换为天冬酰胺)和R190S(将精氨酸替换为丝氨酸)，并在S蛋白中引入了两个新的N-糖基化位—N20和N188。N17与N20相隔较近，作者采用了¹⁸O标记法标记了VNFTNR肽段，HCD MS/MS谱显示b和y片段离子序列，证实¹⁸O标记仅在N20 (MS1, y2, y3, y4, y5，差值为2.98 Da)，确认了Gamma中新引入的位点N20存在N-糖基化，而原本的N17位点没有糖基化(图4)。与WT的N17位点相比，Gamma的N20位点存在类似N-聚糖，N1134位点的唾液酸增加，N282、N709、N1074位点的唾液酸减少。与Beta变异体一样，Gamma也只在N61、N234、N343、N801和N1074位点甘露糖增多；N61、N122、N801、N1074和N1098位点的岩藻糖化减少(图1、2、3)。Gamma变体也显示Core-1型O-聚糖在T323的比例较低(图2)。

图4 .¹⁸O同位素标记技术确认Gamma变体S蛋白的N20位点和N17位点的N-糖基化

Delta (B.1.617.2) SARS CoV 2的变体中除N17外，所有N-糖基化位点都被检测到，Delta与WT差异显著的位点比较显示，N149、N616和N1098位点的唾液酸增加，而N165、N282、N331、N657、N709、N1074和N1134位点的唾液酸减少；高甘露糖型聚糖在N61、N122、N165、N234、N343、N709、N717、N801和N1074位点丰度增加，而在N1098位点丰度降低；岩藻糖在N61、N122、N717、N801和N1074位点降低(图1、2、3)。与早期的突变体一样，Delta变异体在T323位点的core-1 O-糖相对比例也较低(图2)。

SARS CoV 2的Omicron (B.1.1.529)变异体是突变最多的变体。Omicron变异体保留了所有N-和O-糖位点，但糖型有显著差异，唾液酸在N17、N122、N149、N165、N282、N343、N603、N709、N1134、N1173和N1194位点减少，仅在N74位点增加；N165、N234、N343、N717、N801和N1074位点甘露糖含量增加，N61、N1098位点甘露糖含量降低；N17、N61和N801位点的岩藻化降低，这与之前所有VOCs的趋势相同。与之前的版本相比，Omicron变异体最显著的区别是 N17、N74、N149和N657未糖基化的比例上升(图1、2、3)，而T323位点的O-糖基化位点的比例更高。

3. 各变异体S蛋白上N-糖基化和O-糖基化的总体分布

对VOCs S蛋白的N-糖分析，WT含有13%的甘露糖型聚糖，而Alpha(21%)、Beta(24%)、Gamma(24%)、Delta(23%)和Omicron(25%)变体都比WT含有更多的甘露糖。位点特异性分析显示，与WT S蛋白相比，VOCs在多个位点的甘露糖含量增加，在所有VOCs蛋白和WT中都发现了core 1的O-糖，其中WT和Omicron的蛋白显示了较高的O-糖比例，core 1和core 2的糖基都存在(图5)。

图5 VOCs中N-和O-糖在的分布及WT和VOCs中最丰富的10种糖型的相对丰度比较

4. O -糖基化位点在VOCs中是保守的

O-糖基化参与蛋白质的功能和稳定性，病毒O-糖基化作用在病毒蛋白的生物活性中起重要作用。研究人员对SARS-CoV-2 S蛋白(包括从感染患者中分离的病毒颗粒)的糖基化进行了分析，明确发现T323位点的O-糖基化。所有的变异体在T323位点都含有唾液酸化的O-糖，WT的该位点O-糖比例最高(3.38%)(图3)，其次是Omicron变体(1.62%)。Alpha、Beta、Gamma和Delta变体在T323位点具有相似的非糖肽相对比例(分别为99.8%、99.7%、99.8%和99.5%)，发生糖基化的比例仅为0.5%。这些观察表明，RBD域内T323的O-糖基化修饰受到S蛋白构象变化的影响。在多次突变后，T323位点在SARS-CoV-2(WT和VOCs)中仍被保留下来，而且该位点的糖型也较为保守。这一数据表明低水平的O-糖基化可能在病毒与宿主的结合中发挥重要作用，然而，较低的相对比例可能表明，与RBD中的N-聚糖相比，O-聚糖对S蛋白功能的影响更低。

研究结论

本文作者概述了6种SARS-CoV-2 S蛋白(WT，Alpha，Beta，Gamma，Delta，Omicron)上存在的N-和O-糖位点和糖型的全面分析，证实了所有22个N-糖基化位点在WT、Alpha、Beta、Gamma和Omicron变体中都是保守的，而在Delta变体中有21个位点是保守的，与WT S蛋白相比，Alpha到Delta的复杂型聚糖的总体比例依次降低，Omicron变异体也表现出复杂型聚糖的下降，这些聚糖变化体现了糖基化对SARS-CoV-2生存和传播的重要性。

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