来源：百小蓁发布时间：2023-05-12浏览量：91次
编者按：
抗体-药物偶联物（ADC）是通过化学连接子将效应分子与单克隆抗体（mAbs）结合而形成的。对ADC的关键质量属性（CQA），如药物抗体比（DAR）、药物负荷分布和药物结合位点进行全面评估对药物开发至关重要。其中，药物结合位点由于影响ADC的稳定性和药代动力学受到广泛关注，然而，由于技术挑战，很少有研究关注这一领域的方法开发。
2023年2月，来自中国科学院上海药物所的团队在Analytica Chimica Acta（IF=6.911）发表了题为“Conjugation site characterization of antibody–drug conjugates using electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD)”的文章。EThcD碎裂模式（将电子转移裂解（ETD）和高能碰撞解离（HCD）相结合）产生的碎片离子比传统的HCD碎片更多，这有助于识别和定位翻译后修饰。在EThcD碎裂模式下，作者使用PEAKS AB分析软件表征ADC药物的结合位点，包括随机偶联和位点特异性偶联，此研究可能有助于各种临床前和临床ADC的质量控制。
ADC药物结合位点分析难点：
1、效应分子通常具有高度疏水性，导致效应分子偶联的肽段在液相色谱分离过程中洗脱时间更晚。
2、与其他类型的PTM相比，效应分子相对较大且结构复杂（约1000-2000 Da）。
3、效应分子容易受到碰撞诱导的碎片化的影响，会显著削弱偶联肽段的电离效率。这对质谱分析结果的重现性造成影响。
肽图分析方法优化：
采用T-DM1样品作为ADC模型，包含92个潜在的结合位点，包括88个赖氨酸残基和4个N-末端氨基。由于结合位点多，小分子偶联的随机性强，增加了分析难度。作者优化了关键的LC–MS/MS参数以满足分析需求，包括液相色谱梯度、动态排除、AGC和IT。
1、在调整液相色谱梯度时，作者考虑了总的二级肽段谱图数（PSMs）和效应分子偶联PSMs之间的平衡。对比了两种不同梯度条件下的DM1偶联肽段的PSMs的数量，发现梯度2条件下的效应分子偶联PSMs被更有效地分离（图1B）。这样可以减少共溶并改善了偶联肽段的质谱检测质量。
2、设置动态排除过滤已经碎片化的母体离子，提高低丰度偶联肽段的检测。因此，在HCD条件的基础上，AGC和IT增加20%时，偶联肽段MS/MS谱图的比例有所增加（图1C）。
图1 | 肽图分析工作流程和分析T-DM1的LC–MS/MS参数优化。
通过EThcD表征ADC随机偶联位点
使用EThcd碎裂方式分析T-DM1偶联位点，在62个软件鉴定的结合位点中，58个（16个在轻链，42个在重链）具有DM1相关的特征离子。在手动检查MS/MS谱图的过程中，发现一些有趣的肽段。如图2A中，由于MS/MS谱图中缺乏DM1特征离子，该肽段的验证受到影响；图2B中，肽段“SCDK（DM1）THTCPCPPELLGGPSVFLFPPKPK”具有特征离子和3个可能偶联DM1的赖氨酸位点，但是MS/MS谱图中没有赖氨酸位点完全断开的片段离子，就无法确认K4处的DM1偶联；图2C中，肽段“FTISATSK（DM1）NTAYLQMN”没有观察到特征离子，但是K9偶联位点的片段离子有助于正确识别位点。如图2D所示，EThcD可以准确定位K4偶联的DM1效应分子，而HCD不能准确定位。
图2 | 利用片段离子验证可靠的ADC偶联位点
尽管PTM搜索可能存在很高的错误发现率，这项研究首次报道了使用偶联位点的片段离子来评估软件搜索结果。HCD和EThcD分别鉴定了近56个和46个可靠的结合位点（图3A），不过经过手动检查特征离子和片段离子后，EThcD鉴定到的MS/MS图谱的可信度高于HCD。
T-DM1的赖氨酸残基的DM1修饰可能由于空间或静电阻碍影响了蛋白酶的水解。因此，胰蛋白酶的酶解肽段具有更多的不完全酶解和更长的肽段，这适合于使用ETD裂解。总体而言，EThcD可能更适合ADC结合位点的表征。
另外还发现，在EThcD下，所有手动验证的偶联位点的MS/MS图谱得分略低于HCD数据（图3D）。理论上，偶联肽段对EThcD表现出更好的裂解。一种可能的解释是，尽管已经调整了一些软件工具来处理ETD数据，但EThcD数据分析中存在一些不足。首先，b/y和c/z离子序列在合并后具有更高的指定错误率；其次，ETD产生的非c/z碎片离子数量越高（例如带电的还原母离子和无法解释的峰），错误分配的几率就越大。因此开发用于优化现有程序的新算法可以最大限度地发挥EThcD碎片化的优势。
图3 | 用于T-DM1偶联位点表征的EThcD和HCD的比较
通过EThcD表征ADC特异性偶联位点
ADC-134-4是K251位点偶联的ADC药物，携带MMAE作为效应分子。其特征碎片离子为m/z 718.5，HCD碎裂倾向于裂解MMAE分子产生m/z 506.36的碎片离子。尽管图4A中的MS/MS光谱观察到与MMAE相关的特征离子506.36，但HCD碎裂在可能的偶联位点K249和K251附近不存在片段离子，而EThcD 碎裂下MS/MS图谱中的片段离子有很好的碎裂，有助于验证偶联位点（图4B）。
同样，应用HCD和EThcD表征ADC-10-2药物偶联位点，结果发现，与HCD相比，EThcD可以更准确地识别K252为主要结合位点（图4C和图4D）。
图4 | EThcD碎裂精确定位位点特异性ADC的正确偶联位点
结论
ADC偶联位点的表征是一个复杂但有前途的研究领域。作者结合PEAKS AB分析软件，评估了EThcD表征ADC偶联位点的可能性。EThcD碎裂产生了更多的主链断裂，提高了修饰位点定位的精确度。与HCD相比，EThcD在随机偶联和特异性偶联位点的鉴定中均观察到更高比例的可信MS/MS图谱。总体来说，将胰蛋白酶消化、60分钟液相色谱分离、EThcD碎裂和PEAKS AB软件搜索相结合来进行ADC药物偶联位点的表征，是ADC药物质量控制的一种很有潜力的方法。
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