来源：百小蓁发布时间：2023-05-12浏览量：49次
编者按：
抗体-药物偶联物（ADC）是通过化学连接子将效应分子与单克隆抗体（mAbs）结合而形成的。对ADC的关键质量属性（CQA），如药物抗体比（DAR）、药物负荷分布和药物结合位点进行全面评估对药物开发至关重要。其中，药物结合位点由于影响ADC的稳定性和药代动力学受到广泛关注，然而，由于技术挑战，很少有研究关注这一领域的方法开发。
2023年2月，来自中国科学院上海药物所的团队在Analytica Chimica Acta（IF=6.911）发表了题为“Conjugation site characterization of antibody–drug conjugates using electron-transfer/higher-energy collision dissociation (EThcD)”的文章。EThcD碎裂模式（将电子转移裂解（ETD）和高能碰撞解离（HCD）相结合）产生的碎片离子比传统的HCD碎片更多，这有助于识别和定位翻译后修饰。在EThcD碎裂模式下，作者使用PEAKS AB分析软件表征ADC药物的结合位点，包括随机偶联和位点特异性偶联，此研究可能有助于各种临床前和临床ADC的质量控制。
ADC药物结合位点分析难点：
1、效应分子通常具有高度疏水性，导致效应分子偶联的肽段在液相色谱分离过程中洗脱时间更晚。
2、与其他类型的PTM相比，效应分子相对较大且结构复杂（约1000-2000 Da）。
3、效应分子容易受到碰撞诱导的碎片化的影响，会显著削弱偶联肽段的电离效率。这对质谱分析结果的重现性造成影响。
肽图分析方法优化：
采用T-DM1样品作为ADC模型，包含92个潜在的结合位点，包括88个赖氨酸残基和4个N-末端氨基。由于结合位点多，小分子偶联的随机性强，增加了分析难度。作者优化了关键的LC–MS/MS参数以满足分析需求，包括液相色谱梯度、动态排除、AGC和IT。
1、在调整液相色谱梯度时，作者考虑了总的二级肽段谱图数（PSMs）和效应分子偶联PSMs之间的平衡。对比了两种不同梯度条件下的DM1偶联肽段的PSMs的数量，发现梯度2条件下的效应分子偶联PSMs被更有效地分离（图1B）。这样可以减少共溶并改善了偶联肽段的质谱检测质量。
2、设置动态排除过滤已经碎片化的母体离子，提高低丰度偶联肽段的检测。因此，在HCD条件的基础上，AGC和IT增加20%时，偶联肽段MS/MS谱图的比例有所增加（图1C）。
图1 | 肽图分析工作流程和分析T-DM1的LC–MS/MS参数优化。
通过EThcD表征ADC随机偶联位点
使用EThcd碎裂方式分析T-DM1偶联位点，在62个软件鉴定的结合位点中，58个（16个在轻链，42个在重链）具有DM1相关的特征离子。在手动检查MS/MS谱图的过程中，发现一些有趣的肽段。如图2A中，由于MS/MS谱图中缺乏DM1特征离子，该肽段的验证受到影响；图2B中，肽段“SCDK（DM1）THTCPCPPELLGGPSVFLFPPKPK”具有特征离子和3个可能偶联DM1的赖氨酸位点，但是MS/MS谱图中没有赖氨酸位点完全断开的片段离子，就无法确认K4处的DM1偶联；图2C中，肽段“FTISATSK（DM1）NTAYLQMN”没有观察到特征离子，但是K9偶联位点的片段离子有助于正确识别位点。如图2D所示，EThcD可以准确定位K4偶联的DM1效应分子，而HCD不能准确定位。
图2 | 利用片段离子验证可靠的ADC偶联位点
尽管PTM搜索可能存在很高的错误发现率，这项研究首次报道了使用偶联位点的片段离子来评估软件搜索结果。HCD和EThcD分别鉴定了近56个和46个可靠的结合位点（图3A），不过经过手动检查特征离子和片段离子后，EThcD鉴定到的MS/MS图谱的可信度高于HCD。
T-DM1的赖氨酸残基的DM1修饰可能由于空间或静电阻碍影响了蛋白酶的水解。因此，胰蛋白酶的酶解肽段具有更多的不完全酶解和更长的肽段，这适合于使用ETD裂解。总体而言，EThcD可能更适合ADC结合位点的表征。
另外还发现，在EThcD下，所有手动验证的偶联位点的MS/MS图谱得分略低于HCD数据（图3D）。理论上，偶联肽段对EThcD表现出更好的裂解。一种可能的解释是，尽管已经调整了一些软件工具来处理ETD数据，但EThcD数据分析中存在一些不足。首先，b/y和c/z离子序列在合并后具有更高的指定错误率；其次，ETD产生的非c/z碎片离子数量越高（例如带电的还原母离子和无法解释的峰），错误分配的几率就越大。因此开发用于优化现有程序的新算法可以最大限度地发挥EThcD碎片化的优势。
图3 | 用于T-DM1偶联位点表征的EThcD和HCD的比较
通过EThcD表征ADC特异性偶联位点
ADC-134-4是K251位点偶联的ADC药物，携带MMAE作为效应分子。其特征碎片离子为m/z 718.5，HCD碎裂倾向于裂解MMAE分子产生m/z 506.36的碎片离子。尽管图4A中的MS/MS光谱观察到与MMAE相关的特征离子506.36，但HCD碎裂在可能的偶联位点K249和K251附近不存在片段离子，而EThcD 碎裂下MS/MS图谱中的片段离子有很好的碎裂，有助于验证偶联位点（图4B）。
同样，应用HCD和EThcD表征ADC-10-2药物偶联位点，结果发现，与HCD相比，EThcD可以更准确地识别K252为主要结合位点（图4C和图4D）。
图4 | EThcD碎裂精确定位位点特异性ADC的正确偶联位点
结论
ADC偶联位点的表征是一个复杂但有前途的研究领域。作者结合PEAKS AB分析软件，评估了EThcD表征ADC偶联位点的可能性。EThcD碎裂产生了更多的主链断裂，提高了修饰位点定位的精确度。与HCD相比，EThcD在随机偶联和特异性偶联位点的鉴定中均观察到更高比例的可信MS/MS图谱。总体来说，将胰蛋白酶消化、60分钟液相色谱分离、EThcD碎裂和PEAKS AB软件搜索相结合来进行ADC药物偶联位点的表征，是ADC药物质量控制的一种很有潜力的方法。
正确的分子结构是保证蛋白质药物安全、有效的物质基础。对蛋白质药物进行全面的表征研究是进行质量控制的重要手段。百蓁生物采用先进的质谱仪器和分析软件提供有挑战性的表征技术服务，包括：突变序列测序（基于 de novo 算法的 PEAKS 软件），二硫键配对分析，糖基化表征分析、ADC药物位点和DAR值表征分析以及其他基于质谱技术的常规蛋白表征服务，如：分子量分析，肽图覆盖率分析，N端和C端测序，翻译后修饰的定性定量分析、宿主蛋白残留分析等服务。
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