文献解析丨《Nature》肿瘤内微生物多肽-免疫治疗的新靶点_百蓁生物-抗体蛋白从头测序/新抗原发现/免疫肽组分析

2020年Nejman 等发表在Science的文章对7种癌症类型1526个肿瘤及其邻近正常组织的肿瘤微生物组分析发现每种肿瘤内都有不同的菌群组成，这些在肿瘤内定殖的微生物称为肿瘤微生物。
2021年Wong-Rolle等发表在Protein Cell上的综述详细说明了瘤内微生物通过调节肿瘤微环境进而影响肿瘤的发生和发展。
既然肿瘤中有微生物的存在，并且微生物通过导致微环境的改变影响免疫系统，那么免疫系统是否能识别肿瘤内的微生物本身呢？来自肿瘤细胞内微生物的抗原是否由肿瘤细胞的HLA-I和HLA-II分子呈递呢？是否会引发T细胞免疫应答呢？瘤内微生物是否可以作为肿瘤的特异性抗原呢？

2021 年 3 月 17 日，来自以色列魏茨曼科学研究所的 Shelly Kalaora 团队在 Nature 发表的题为 Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma 的研究论文解答了上述疑问。研究通过16S rRNA基因测序获得了黑色素瘤的细菌基因组图谱，然后使用HLA肽组学（HLA peptidomics）的方法来鉴定能够被免疫系统识别的肿瘤抗原肽，最终鉴定出了黑色素瘤细胞表面的来自41种不同细菌的近300种肽，其由HLA蛋白复合物呈递。研究揭示了来源于肿瘤细胞内细菌的多肽可以被呈递到肿瘤细胞表面并引发免疫反应，这一发现将可能被用于癌症的免疫治疗。

研究结果

黑色素瘤内细菌种类的鉴定

对来自9名黑色素瘤患者的17个黑色素瘤样本进行16S rRNA基因测序，发现了41种不同的细菌。微生物系统发育树结果显示，在同一患者的不同转移瘤中发现的细菌组成具有高度相似性，而且不同患者的肿瘤样本中也存在高度相似性。这一发现说明黑色素瘤存在常见的细菌种类。研究人员还发现，相比于血液样本，七种细菌在肿瘤样本中表现出更高的丰度。

图1. 黑色素瘤瘤内细菌的鉴定

细菌肽的呈递

对16S rRNA基因测序的相同肿瘤进行HLA（human leukocyte antigen, 人类白细胞抗原）肽组分析，使用软件进行数据库搜索，数据库包括黑色素瘤内鉴定的细菌及人类蛋白质组。分析得到了248条独特的HLA-I肽段和35条独特的HLA-II肽段，肽段长度分布与HLA-I和HLA-II肽的预期长度一致。通过将肽段的质谱图与人工合成肽段的质谱图进行比较，验证了48条肽段。
作者从每个转移瘤中获得了0到16个HLA-I和HLA-II肽，从每种细菌中获得0到45个不同的HLA-I和HLA II肽（图2a）。鉴定了11条来自核梭杆菌、金黄色葡萄球菌和头葡萄球菌的共同肽段，其中5条出现在同一患者的不同转移瘤中，6条出现在不同患者中（图2b）。
与人类蛋白质组相比，细菌蛋白质组含有更高比例的疏水性氨基酸，这一特性可能使细菌肽更适合抗原呈递和T细胞识别。作者还发现HLA-C*03:04、HLA-C*03:03和HLA-A*02:01等位基因与更多疏水性肽结合，因此这些等位基因呈现出更高频率的细菌肽（图2c）。
为确保鉴定的HLA肽确实是HLA配体，作者将HLA-I-null B细胞系721.221与有核梭状芽胞杆菌共培养，并进行HLA肽组学研究。如预期所示，仅在过度表达HLA-A*01:01等位基因的细胞中观察到HLA-A*01:01细菌肽；在没有过度表达HLA-A*01:01的721.221细胞中未发现这些肽。

图2 .细菌肽的特征

细菌进入黑色素瘤细胞

为了全面评估黑色素瘤细胞是否能呈现细菌HLA肽，作者首先确认了在黑色素瘤患者肿瘤中鉴定的细菌种类能够进入黑色素瘤细胞，为此，将来自同一黑色素瘤肿瘤的原代细胞系（51AL和55A3）与具有代表性的胞内细菌（S. caprae和A odontolyticus）共培养，结果发现，与对照相比，已鉴定的胞内细菌S. caprae和A. odontolyticus对肿瘤细胞的侵袭作用更强。
作者使用抗脂磷壁酸对S. caprae共培养的51AL和55A3 GFP表达细胞进行免疫荧光染色，进一步验证了黑色素瘤细胞内是否存在细菌。同时，使用无铜点击化学，用DIBO-Alexa Fluor 48832标记厌氧生长的F. nucleatum和 A. odontolyticus，并将这些细菌与用抗HLA-I染色的51AL和55A3细胞共培养（图3b）。结果在两种黑色素瘤细胞系中都检测到了三种细菌。对与F. nucleatum、A. odontolyticus和S. caprae共培养并用抗脂磷壁酸染色的细胞进行相关的光学和电子显微镜分析，证实细菌确实进入黑色素瘤细胞（图3c）。

图3. 细菌进入黑色素瘤细胞并被呈递的证据

细胞呈递的特异性

作者对51AL细胞+F. nucleatum和55A3细胞+S. caprae共培养得到的细菌肽进行HLA肽组分析，发现与细菌共培养的细胞中有105个HLA-I和130个HLA-II肽。使用基因组编辑敲除细胞中的β-微球蛋白或II类主要组织相容性复合物反式激活子基因分别降低了HLA-I和HLA-II的表达，并导致与细菌共培养后的HLA-I-和HLA-II相关肽的数量减少（图3d）。此外，将细胞与植物乳杆菌或动物乳杆菌共培养（它们的细胞侵袭性小于F. nucleatum和 S. caprae），产生更少的HLA-I和HLA-II结合肽（图3d）。HLA基因敲除和侵袭性较小的细菌对照实验都表明，我们鉴定的细菌肽是HLA配体，因为在两个对照实验中，它们的存在都大大减少。

与肿瘤分离后细菌表现

作者对从肿瘤中分离的细菌和用于共培养的细菌进行了全基因组测序。然后从全基因组测序数据构建了一个蛋白质组数据库，并以类似于UniProt数据库的方式分析了HLA肽组数据。在大多数实验中，两种分析中确定的肽的重叠程度很高，这表明使用已发表的蛋白质组，即使它们不是在肿瘤中确定的特定菌株，也可以给出非常接近的鉴定结果。这个结果表明，使用16S rRNA测序和UniProt数据库的组合具有明显的优势，可以减少从肿瘤中分离和测序细菌的复杂流程，也可以得到一个比较接近的鉴定结果。

细菌肽中的“热点”

作者发现在共培养细胞系的HLA肽组中鉴定出的两种HLA-I肽也在相应的肿瘤样本中被鉴定出来：GLDLGTLTY（在51号患者的27号转移灶中被鉴定）和GVDLGTLTY（在同一患者的51BR号转移瘤被鉴定，在与F. nucleatum共培养的51AL细胞中也发现了此肽）。在51AL黑色素瘤细胞和721.221 B细胞中都发现了一种肽，两对不同的肽具有重叠序列，其他基因显示出更多的重叠肽，这揭示了“热点”细菌肽的存在。这些热点细菌肽可能是免疫治疗的新靶点。

细菌肽的免疫原性

为了验证细菌肽的免疫原性，作者分析了从肿瘤中分离的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）对鉴定的HLA-I结合的细菌抗原的反应性。将合成的细菌肽脉冲注射到表达肿瘤匹配HLA等位基因的EB病毒转化的B细胞上，将负载的B细胞与自体TILs共培养，使用流式细胞术检测TIL的反应性。结果显示，与未装载这些肽的对照B细胞相比，八种不同的细菌肽装载下分泌IFN-γ的TILs增加了两倍或更多（图4）。包括7个来自51号患者的免疫原性肽和一个来自55号患者的肽。作者还通过CD69 T细胞反应性标记物的流式细胞术分析证实了这些结果。

图4. 细菌源性抗原对TIL的反应性

小结

作者对黑色素瘤的瘤内微生物群和来源于这些细菌的HLA肽的综合分析表明，定殖于黑色素瘤的细菌可以进入黑色素瘤细胞，来源于细菌的多肽可由黑色素瘤的HLA-I和HLA-II分子呈现。由于这两类HLA分子在CD8+和CD4+ T细胞免疫中都起着核心作用，因此有望最终调节免疫功能。此研究为肿瘤微生物和免疫治疗的相关性提供了新的方向。

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