编者按：

病毒突变与免疫逃逸是司空见惯的问题。当病毒感染人体细胞时，被感染细胞内会表达一系列病毒蛋白，这些蛋白质被Ⅰ类人类白细胞抗原（HLA-I）加工并呈现在宿主细胞表面，循环细胞毒性T细胞识别呈现的外源抗原并启动免疫反应，从而清除被感染的细胞。因此，研究SARS-CoV-2衍生的HLA-I肽序列将有助于识别与细胞毒性T细胞活化有关的病毒表位，继而为抗病毒治疗研究、疫苗研究，提供一些新的思考。

2021年5月，来自麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所Pardis C.Sabeti团队在Cell（IF=66.85）发表了题为“Profiling SARS-CoV-2 HLA-I peptidome reveals T cell epitopes from out-of-frame ORFs”的文章。该研究通过质谱法对新冠病毒感染细胞系进行了HLA-I免疫肽组的系统分析，不仅检测到了来源于经典的ORF区（Canonical ORF）的HLA-I免疫肽，同时也检测到了来源于非经典的ORF区（Non-Canonical ORF）编码的HLA-I免疫肽。结果显示，来自非经典ORF的一些免疫肽在人源化小鼠模型和新冠患者个体中亦可以引发T细胞免疫反应，其免疫原性甚至超过了经典的免疫肽，包括一些迄今为止报道的最强表位。该研究成果发现了源于非经典ORF区域的新冠病毒相关重要抗原表位，将有助于新冠病毒后续的免疫监测和疫苗开发。

研究策略

为了研究人类和病毒HLA-I免疫肽，作者从SARS-CoV-2（简称冠状病毒）感染的人肺A549细胞和HEK293T细胞中免疫沉淀HLA-I多肽，然后使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析HLA结合的多肽。为了检测冠状病毒对人类基因表达的影响，对整个蛋白质组和RNA基因表达进行了检测分析。在冠状病毒中，约25% HLA-I 肽组提呈的均为ORF之外的非经典抗原肽。经过ELISpot验证，发现源于非经典ORF的肽段确实能够激活免疫小鼠及新冠患者的T细胞免疫应答。

技术路线图

研究结果

1）HLA-I肽的鉴定结果

在RNA seq的基础上，作者通过高通量高灵敏度质谱检测技术在未感染和感染的A549细胞中分别鉴定到了5837和6372个HLA结合的免疫肽，同时，在HEK293T细胞中分别鉴定到了4281个和1336个免疫肽。数据分析表明，检测到的免疫肽段长度分布并不受感染的影响，大多数HLA-I肽为9-mers（图1C），符合HLA-I免疫肽段长度的规律。研究人员也比较了每个细胞系HLA等位基因的未感染和感染细胞之间所有9肽的结合基序（图1D），两个细胞系中表达的等位基因的预期结合基序基本一致。研究人员也检测到了来源于冠状病毒的36个多肽，其中27个是经典多肽（Canonical Peptides），9个是来自于S蛋白和N蛋白ORF框外的非经典多肽（Non-Canonical Peptides）。

图1. 感染细胞和未感染细胞中HLA肽的长度分布以及氨基酸序列（9-mer）的基序

2）冠状病毒HLA-I非经典肽

在冠状病毒中检测到9个HLA-I非经典肽中，HEK293T细胞中检测到7种HLA-I非经典肽（GPMVLRGLIT、GLITLSYHL和MLLGSMLYM，SLEDKAFQL、KAFQLTPIAV、ELPDEFVVV和ELPDEFVVTV），A549细胞中检测到2种HLA-I非经典肽（LEDKAFQL和DEFVVTV），如图2A和图2B所示。有趣的是，在所有生化实验测试的HLA-I肽中，亲和力最高的3种肽是来自于ORF框外的非经典肽（图2D），说明非经典肽的在抗原呈递中的重要性。

图2. 非经典肽的区域与生化实验肽结合能力检测

3）HLA-I非经典肽在人源化小鼠和新冠患者个体中T细胞反应

为了评估质谱检测到的HLA-I肽的免疫原性，研究人员首先在人源化小鼠模型中验证了相关免疫肽的T细胞反应情况。同时，使用ELISpot实验分析测试了T细胞对特定肽段的反应，结果显示三种来自ORF框外的非经典肽（GLITLSYHL、MLLGSMLYM，ELPDEFVVTV）和一种来自nsp3（YLNSTNVTI）的经典肽呈现阳性反应（图3A和3B）。然后又对6名新冠康复患者的外周血单个核细胞（PBMC）进行了ELISpot分析，检查了15个HLA-I经典肽和7个非经典肽的免疫原性。结果显示，6例样本中有2例样本中观察到阳性反应（图3C和3D），其中在1例样本中非经典肽的响应强度超过了已发表的102个免疫肽混合库的响应强度。

图3. HLA-I非经典肽在人源化小鼠和新冠患者个体中T细胞的反应

小编总结

本文通过质谱检测技术发现了两类冠状病毒感染的人类细胞系中HLA-I免疫肽组，结果发现，来源于ORF框外的一些非经典肽在人源化小鼠模型和新冠患者个体中可以引发较好的T细胞免疫反应，响应强度甚至超过了一些迄今为止报道的最强表位在内的典型免疫肽。该项研究不仅可能为研制更有效、更强大的冠状病毒疫苗打开新的窗户，而且也为其他抗病毒疫苗的研究提供新的研究思路。

质谱分析是目前公认的唯一一种全面检测免疫肽组的方法，可以为HLA-I的鉴定提供最直接的证据。HLA-I免疫肽组的大规模质谱检测的灵敏度和准确性在过去几年中有了显著的提高。然而数据分析阶段仍需创建一个蛋白质或多肽的参考数据库来识别样品中肽段的序列，故而对于非典型多肽的解析还需要依赖于基因测序的结果，存在着一定的局限性。

百蓁生物基于质谱分析和de novo从头测序技术，不依赖于数据库的构建，利用肿瘤新抗原分析平台——DeepImmu，可以准确直接的鉴定和筛选肿瘤新抗原（neoantigen），并可同时提供完整的典型和非典型免疫肽组信息。