编者按：

单核细胞增多性李斯特菌是最致命的食源性细胞内细菌病原体之一，主要以食物传播，可导致人类患李斯特菌病。李斯特菌病是一种严重的急性传染病，尤其是免疫系统较弱的个体，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者感染后症状较重,甚至可导致死亡。李斯特菌病死亡率高、且抗生素耐药性强，目前仍无临床批准的李斯特菌疫苗可用。

2022年8月19日，来自比利时VIB-UGent医学生物技术中心的Francis Impens团队在Bio-Rxiv发表了题为“Immunopeptidomics-based design of highly effective mRNA vaccine formulations against Listeria monocytogens” 的文章。该文章通过基于质谱法免疫肽组技术筛选出李斯特菌感染人源细胞系后所呈递的抗原表位，在检测到15000多个肽段中，筛选到68个李斯特菌免疫肽，分属于42种细菌蛋白。通过严格的筛选后，其中部分肽段同时表达在两类感染人源细胞系表面，可作为潜在的候选疫苗。将这些高度呈递的抗原利用mRNA galsomes平台制备成脂质纳米颗粒mRNA疫苗进行小鼠疫苗挑战性实验，结果表明疫苗能产生特异性CD8+T细胞反应，从而对感染李斯特菌小鼠产生高度保护。该研究结果为李斯特菌病临床mRNA疫苗的开发铺平了道路，并证明了基于质谱的免疫肽组在新一代细菌疫苗开发中的强大力量。

研究结果

1. 李斯特菌侵染细胞呈递MHC-I型免疫肽组分析（定性与定量）

作者用李斯特菌分别感染Hela和HCT-116细胞系，同时设置对照，每组设置4个生物学重复，每个重复使用3.5~5.4e8细胞。随后，用免疫法将抗原肽富集出，一半样本LC-MS/MS检测，进行非标定量；另一半抗原肽用TMT标记后合并、预分级、LC-MS/MS检测，进行深度标记法定量抗原肽。数据分析采用PEAKS软件，FDR卡值为1%，得到高可信度的抗原肽列表。合并两类定量结果，研究者们一共定量到15776条人源肽段和85条李斯特菌源免疫肽，分析肽段长度分布主要为8-12个氨基酸，符合I型抗原肽的特征（图1）。

图1丨基于质谱的李斯特菌感染后免疫肽组定量流程与结果

作者随后将上述免疫肽列表提交MixMHCp 2.1软件分析富集到大部分这些细胞系特异的HLA allel的motifs。对各组免疫肽质谱强度进行PCA分析，结果表明李斯特菌感染对MHC-I型免疫肽递呈产生重大的影响。（图2）

图2丨基于质谱的李斯特菌感染后免疫肽组结果

2. 筛选高可信度的李斯特菌抗原肽

接下来，作者严格筛选出可信度高的抗原肽。这些肽段必须同时符合以下标准：1）至少在两个样本被PEAKS软件鉴定到；2）与对照相比，感染后抗原肽表达量升高；3）这些肽段用人源数据库搜索，去除I/L干扰；4）删除与人源数据库匹配的肽段。根据以上条件，筛选到68条高度可信肽段，来自于42个李斯特菌蛋白。其中，58条肽段经预测与至少一种细胞的HLA allel具有结合力。除此之外，作者还合成了其中24条肽段，与实验测得的数据进行二级谱比对，所有参与比对的肽段都展示了较高的相关度。有意思的是，分析两个细胞系鉴定到的抗原肽发现，仅鉴定一条相同的抗原肽。（图3）

图3丨李斯特菌免疫肽组筛选与表征

3. mRNA疫苗携带高呈递的抗原发挥预防保护作用

为了研究这些高呈递抗原肽确实能提高机体对李斯特菌的免疫力，作者选择7个李斯特菌抗原蛋白（图4），分别都有2-3个抗原肽被鉴定到，且不存在已知毒性或酶活，作为mRNA疫苗备选。将这7个抗原蛋白制作成mRNA疫苗，并用脂质体包裹，通过小鼠尾部静脉注射进入体内。在疫苗注射28天后，对小鼠进行疫苗挑战性实验，注射李斯特菌。3天后，取出小鼠的肝脏、脾脏统计李斯特菌CFU（colony-forming units）。结果都表明，与对照（注射OVA）相比，所有注射了编码李斯特菌抗原蛋白mRNA galsome纳米颗粒的小鼠都显示脾脏、肝脏具有较少的细菌CFU。（图4）

除此之外，研究者还测试了mRNA疫苗是否引起了CD8+细胞响应，结果表明，lmon_0149蛋白两条肽段YSYKFIRV和QVFEGLYTL都能引起CD8+细胞响应，表明mRNA疫苗lmon_0149诱导特异CD8+Tcell响应。

图4丨mRNA疫苗挑战性实验表明疫苗对小鼠的免疫系统具有保护作用

小编总结

研究者用李斯特菌感染两种人源上皮细胞系，通过免疫肽组方法结合非标记定量、同位素标记深度定量等策略，在大量人源的免疫肽中找到丰度极低的李斯特菌抗原肽，并对它们进行相对定量，找到感染后高表达的李斯特菌抗原肽。用这些高表达的抗原肽制作的mRNA疫苗可显著降低小鼠肝脏和脾脏中的细菌数量。该研究提供了基于质谱技术李斯特菌mRNA疫苗研发的重要方向，也为利用免疫肽组技术研发mRNA疫苗提供了一个新的策略和范本。