2024年6月24日，上海交通大学医学院附属瑞金医院胰腺疾病诊疗中心沈柏用教授、上海信谱生物医药科技有限公司赵明、瑞金医院胰腺疾病研究所蒋玲曦研究员、符达研究员等以共同通讯作者身份在国际医学顶刊Cell Research（IF 28.1，Q1）在线发表了mRNA肿瘤疫苗研究新进展: Combination therapy of KRAS G12V mRNA vaccine and pembrolizumab: clinical benefit in patients with advanced solid tumors，该研究报道了针对KRAS G12V单靶点的mRNA肿瘤疫苗在实体瘤中的治疗效果。

本研究首先通过质谱法验证了KRAS G12V新抗原的表达和呈递及其与HLA-A*11:01的结合。通过四聚体染色实验、ELISPOT实验，以及用KRAS G12V mRNA疫苗处理HLA-A*11:01小鼠，证实了KRAS G12V mRNA疫苗可以诱导抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。随后，作者报告了2例接受KRASG12VmRNA疫苗和pd-1抑制剂联合治疗的病例的临床疗效。通过体外PBMC刺激和患者KRAS G12V特异性T细胞检测，ICS实验，TCR测序，四聚体染色实验，肽脉冲和共培养实验，进一步研究了与联合治疗相关的免疫应答。百蓁生物为本研究提供了新抗原质谱检测与分析服务。HLA肽的富集由百蓁生物商业化的新抗原样品制备试剂盒完成，质谱数据的分析工作由PEAKS^® Online软件（版本11）的DeepNovo^®免疫肽组工作流完成。

KRAS与高致命性癌症有关，如胰腺导管腺癌(PDAC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。已知在多个肽-MHC组合中，KRAS G12V-HLA-A*11:01有最强的亲和力，诱导T细胞反应的成功率最高，对肿瘤细胞的杀伤作用最明显。研究者使用质谱法验证了KRAS G12V新抗原的表达和呈递及其与HLA-A*11:01的结合(图S1)。通过四聚体染色实验、ELISPOT实验，以及用KRAS G12V mRNA疫苗处理HLA-A*11:01小鼠，证明了KRAS G12V mRNA疫苗可以诱导G12V特异性T细胞在体内的扩增(图S2 a,b)和激活(图S2 c,d)，随后减缓了携带有KRAS G12V肿瘤的生长(图S2 e,f)。这些临床前研究结果证实了KRAS G12V mRNA疫苗可以诱导抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。

图S1 HLA-A*11:01上的KRAS G12V的靶向质谱分析。LC/MS的二级质谱图表明，HLA-A*11:01能够在细胞表面呈现9肽(VVGAVGVGK)(a)和10肽(VVVGAVGVGK)(b)。

图S2 KRAS G12V mRNA疫苗对HLA-A*11:01小鼠体内KRAS G12V特异性T细胞的扩增和激活作用

随后，研究者报告了2例接受KRAS G12V mRNA疫苗和PD-1抑制剂联合治疗的病例。两名患者肿瘤组织的全外显子测序和转录组测序表明其携带KRAS G12V突变，HLA分型为HLA-A*11:01。

患者-001，86岁女性，因梗阻性黄疸就诊，确诊为局部晚期胰腺癌。考虑患者的年龄和身体状况，未行手术和化疗。经内窥镜逆行胰胆管造影术(ERCP)，肿瘤进展，胆道梗阻再次发生。患者选择了mRNA疫苗联合PD-1抑制剂治疗(图1a)。在治疗期间出现了可控的不良反应，包括接种疫苗后发烧。治疗3个周期后，胰头肿瘤病变在第一次随访时消退(图1b)。

患者-002，69岁男性，确诊为晚期非小细胞肺癌后接受了六个周期的化疗联合免疫治疗，出现明显的耐药性和严重的不良反应。患者停止化疗，并选择了mRNA疫苗联合PD-1抑制剂治疗9个周期(图1a)。除了预期的发烧或注射部位疼痛外，患者也没有其他不良反应(图1c)。

图1 晚期实体瘤中靶向KRAS G12 V突变（HLA-A*11：01限制性）mRNA疫苗的临床获益及特异性T细胞检测。

接下来，研究了与联合治疗相关的免疫应答。在KRAS G12V多肽抗原(图1d)或mRNA编码的抗原体外刺激(图S3)后，在两名患者接种后的外周血中检测到了HLA-A*11:01限制性的KRAS G12V特异性CD8 T细胞。细胞内染色数据证实抗原特异性T细胞是多功能CTL，并在抗原刺激下释放IFN-γ和TNF-α(图S4)。患者002 PBMC的TCR测序分析揭示了几个T细胞克隆(图1e的克隆1、2和5)的扩增。为了明确这些克隆是否是KRAS G12V特异性的，进一步用KRAS G12V肽刺激接种后的PBMC10天，用FACS对HLA-A*11:01-KRAS G12V 四聚体阳性T细胞进行单细胞TCR测序，发现克隆1、2和5的扩增与TCR测序分析观察到的结果相似。然后，将全长的配对TCR-αβ链重新导入Jurkat细胞。发现一旦与装载有KRAS G12 V但不装载有KRAS WT或G12 D肽的PANC-1细胞（表达HLA-A*11：01的胰腺癌细胞系）共培养，工程化Jurkat细胞就被激活（图1f;图S5）。这些结果表明，这三个克隆中的TCR特异性地识别KRAS G12V新表位。

图S3 使用KRAS G12V抗原脉冲后PBMC中KRAS G12V特异性CD8 T细胞的体外检测

图S4 KRAS G12V对免疫后PBMC特异性T细胞的激活

图S5 来自患者-002的KRASG12v特异性tcr对KRAS G12D突变没有反应

本研究报告了mRNA疫苗和检查点抑制剂联合治疗在两名患者中的疗效。与先前报告mRNA疫苗在低肿瘤负荷的术后患者中的疗效的研究不同，本研究重点关注传统治疗无法耐受或者耐药的晚期实体肿瘤患者。另外，靶向单一新抗原的mRNA肿瘤疫苗可以成为一种即用型药物，为治疗窗口有限的患者提供临床可行性。尽管针对肿瘤新抗原的个体化治疗是癌症免疫治疗的令人兴奋的前景，但它们仍处于发展的早期阶段。随着更多的新抗原-HLA对被验证，癌症治疗的新视角可能会出现。根据肿瘤的病理特征和基因组特征指导患者接受正确的治疗是有希望的。