自身免疫性疾病(autoimmune diseases，ADs)是自身反应T细胞或B细胞对自身组织进行攻击，产生局部或全身异常炎症反应的疾病。目前已知的自身免疫疾病超过80种，包括器官特异性ADs和系统性ADs。器官特异性ADs是指患者的病变一般局限于某一特定的器官，由针对特定器官的自身免疫反应引起，主要包括桥本甲状腺炎、Graves病、重症肌无力等。系统性ADs是指免疫反应造成全身多器官和组织的病理损伤，主要包括类风湿性关节炎（RA）、系统性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）等。全球大约有5%-9%的人口受到自身免疫性疾病的威胁，诊断率仍然较低（以IBD为例，诊断率不到20%），实际患者规模更大，导致致残率与死亡率逐年上升，目前自身免疫疾病的诊断与治疗面临着巨大的挑战。

自身免疫性疾病如强直性脊柱炎(AS)可由新出现的新抗原引起，打破了人类的免疫耐受。翻译后修饰(PTMs)已被证明是改变蛋白质结构和功能以产生新抗原和诱导后续自身免疫反应的关键机制。先前的研究已经证实瓜氨酸修饰多肽是类风湿关节炎新抗原的重要来源。然而，AS的新抗原形成和病原性自反应的分子机制在很大程度上是未知的。

2023年3月17日，空军军医大学西京医院朱平教授团队发现了一种全新的蛋白质翻译后修饰——半胱氨酸羧基乙基化修饰。整合素[ITGA2B(CD41)]的半胱氨酸残基在肠道微生物代谢物3-羟基丙酸（3-HPA）和CBS酶的作用下被羧乙基化修饰，产生了致病性新抗原，并被证实是HLA-DRB1*04呈递的一种新的致病性抗原，可引起HLA限制性自身免疫反应。当用ITGA2B-ceC96肽免疫携带人类HLA-DR4等位基因的转基因小鼠时，引起了结肠炎和脊椎骨侵蚀。

研究思路

研究者采用了一个系统方法分析强直性脊柱炎患者中可能的PTMs并且识别与自身反应性新抗原有关的强直性脊柱炎相关性PTMs，整个研究过程包括抗原肽的筛选、修饰的鉴定以及带修饰抗原肽的活性验证。通过LC-MSMS分析了7例AS患者，5例健康患者的PBMC样本，并结合泛蛋白修饰组学鉴定了致病新抗原以及修饰类型，然后通过一系列体外实验、与HLA结合力研究、小鼠实验以及不同疾病中新抗原代谢分析等实验验证了新抗原诱导了强直性脊柱炎的发病。

研究结果

1.AS患者中带修饰肽段的鉴定

为了鉴定AS患者和健康者（HC）外周血单个核细胞（PBMC）中蛋白质的非编码氨基酸（ncAAs）。研究者从AS患者和健康人的PBMC中提取蛋白质，Trypsin酶解后采用C18柱纯化多肽，用质谱分析其氨基酸序列，分析其编码氨基酸和实际氨基酸之间的质量差异。共识别出分布在21716个蛋白质位点的643个独特的质量差，发现AS患者72.021 Da处的delta质量明显增加，进一步聚类分析发现，该质量差在Cys、Arg和Trp残基中最常见，并在AS患者发生的频率比健康患者的高，且在半胱氨酸上发生质量偏差成正态分布，提示修饰可能发生在半胱氨酸上，之后回溯分析发现该修饰残基来源于ITGA2B蛋白上，该蛋白在患者体内的出现频率高，ITGA2B蛋白上有四个半胱氨酸残基，通过对比患者和健康人的半胱氨酸残基修饰结果，发现患者主要在96位Cys发生这种修饰，最终鉴定了AEGGQC(+72.02)PSLLFDLR新抗原在患者体内产生反应。

图| 致病新抗原的筛选过程

2.AS患者中新抗原的修饰以及修饰酶的鉴定

通过质量推测出分子式为C3H4O2，该分子式与羟丙基或羧乙基一致(3-HPA和LA)，研究者通过合成了四种具有#1、#3、#5和#7异构体，未修饰的ITGA2BwtC96肽与LA/2-HPA或3-HPA体外孵育，LC-MSMS分析产物，并结合一系列稳定性实验发现3-HPA使得原生肽发生了修饰，并利用家兔制备了针对羧乙基化ITGA2B-Cys96（ITGA2B-ceC96）多肽的特异性抗体，通过SPR亲和分析以及斑点印迹（Dot blot）检测抗ITGA2BceC96抗体对修饰肽(ceC96)和未修饰肽(wtC96)的亲和力与结合力，最终确定3-HPA诱导了ITGA2B蛋白上的羧乙基化修饰。

图| 半胱氨酸羧乙基化需要的底物—3-HPA的鉴定

为了鉴定催化半胱氨酸羧乙基化的酶，研究者使用抗ITGA2B抗体和抗ITGA2BceC96抗体从过表达ITGA2B的293T细胞裂解物中共免疫沉淀蛋白复合物，利用LC-MS/MS鉴定了两种蛋白质复合物中的差异组分，再通过STRING蛋白质相互作用网络预测了潜在的修饰酶。之后通过体外酶促反应验证，斑点杂交实验和免疫杂交实验验证，发现PTM水平以剂量和时间依赖的方式增加。合成肽ITGA2B-wt96(91-104)和重组蛋白ITGA2B(32-989中的半胱氨酸96在3-HPA和辅因子PLP和AdoMet的存在下被CBS有效地羧化。

图| STRING蛋白质相互作用网络图

图| CBS催化半胱氨酸羧乙基化的实验结果

3.带修饰新抗原的免疫应答反应验证

ITGA2B-ceC96多肽是否能作为新抗原并触发HLA限制性适应性免疫反应，研究者建立了检测自身抗体产生和自身反应性T细胞反应的体外实验，通过ELISA检测126例AS患者和40例健康人血浆中抗ITGA2B-ceC96抗体含量。结果显示，相比于HC，AS患者血浆中抗ITGA2B-ceC96抗体含量显著升高。并对患者HLA分型进行分析，发现均携带与AS相关的HLA-DRB1*04 等位基因。研究者使用wtC96和ceC96与患者来源的成熟树突状细胞（mDC）共孵育后，分别刺激同一患者分离出的CD4+和CD8+T细胞，观察T细胞激活情况。结果显示，DC-ceC96显著诱导CD4+T细胞应答。

为了验证ITGA2B-ceC96多肽是否被HLA-DRB1*04的抗原呈递，研究者构建并验证了包含HLA-DR和HLA-DM复合物的体外呈递系统，并在体外与HLA-DRA/HLA-DRB抗原结合槽中，分别将未修饰(wtC96-27)和修饰(ceC96-27)肽段与原始CLIP肽段(带有链亲和素标签)交换，继而通过Dot blot 实验验证了ceC96-27与HLA-DRA*01/HLA-DRB1*04可以有效结合。

进一步将肽段与HLA复合物的抗原结合袋进行比对。最终的结构对野生型表位表现出高度保守的结合袋；一个羧乙基化的Cys96肽发现可以与HLA分子β链中的Trp60和Gln64(H, top)或与同一肽内的Gln95(H, middle)形成新的氢键，同时也发现在Cys96位点与其羧基侧链进行对接，指向HLA-bding bag (H，底部)。因此，Cys96羧乙基化可能影响与HLA II类分子的结合，并改变可用于TCR识别的分子表面。

图| 羧乙基化和未修饰的ITGA2B肽与HLA-DRB1*04/HLA-DRA*01的结合实验

为了探索ITGA2B-ceC96肽是否能够作为一个新抗原被HLA-DR分子呈递给免疫细胞，并引发抗体和效应T细胞的产生。研究者将ceC96肽段标记了FITC染料，脉冲至DC细胞中，使用多重免疫荧光染色观察HLA-DR或HLA-A/B/C分子与ITGA2B-ceC96肽在细胞表面的共定位。结果显示，只与HLA-DR分子共定位，而不与HLA-A/B/C分子共定位。

在免疫后的第21天和第31天，仅在用ITGA2BceC96(84-110)肽段免疫的小鼠中出现了针对ITGA2B-ceC96的抗体，而用ITGA2B-wtC96(84-110)免疫的小鼠中未出现针对ITGA2B-ceC96的抗体。此外，在用ITGA2B-ceC96免疫的小鼠中，CD138+浆细胞和效应CD4+T细胞的百分比增加。

最后，研究者分析了来自39例强直性脊柱炎(AS)、31例类风湿性关节炎(RA)、25例系统性红斑狼疮(SLE)患者以及15例健康对照组(HCs)的代谢和免疫变化，结果发现AS、RA和SLE患者的PBMCs中均检测到羧乙基化ITGA2B，且明显高于健康供者，AS组、RA组、SLE组中均有HLA-DRB1*04- ceC96 2D四聚体+细胞，显示患者产生自身反应性T细胞，与HCs患者相比，AS、RA、SLE患者血浆中ITGA2B-cec96特异性自身抗体水平显著升高，且相关通路的代谢产物3-HPA和CBS等也均有所升高。

图| ITGA2B-ceC96在AS、RA、SLE和hc患者中代谢和免疫变化的综合分析

结论

本文研究利用LC-MS/MS数据通过修饰组学搜索发现强直性脊柱炎（AS）患者PBMC中富集的氨基酸衍生物——半胱氨酸羧基乙基化修饰，在肠道微生物代谢物3-羟基丙酸（3-HPA）和CBS酶的存在下，整合素[ITGA2B(CD41)]的半胱氨酸残基被羧乙基化修饰，并导致产生了致病新抗原，并证实了由HLA-DRB1*04呈递，可引起HLA限制性自身免疫反应，解释了强直性脊柱炎（AS）的发病机制。