来源：百小蓁发布时间：2023-03-10浏览量：149次
RNA剪接失调是几乎所有肿瘤类型的分子特征，肿瘤相关基因的剪接异常可通过多种机制影响肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移等。近几年的研究发现肿瘤细胞中可变剪接的异常也可促进肿瘤新抗原的产生，增强免疫系统的疗效。本文介绍的研究报道了一种合成化合物RECTAS可以诱导剪接新抗原的产生，可用于增强抗肿瘤免疫反应，越来越多的研究者开始认识到RNA异常剪接及其产物作为肿瘤标志物和靶标的价值。
2022年11月，日本京都大学研究人员在Science Translational Medicine上发表了题为Chemical induction of splice-neoantigens attenuates tumor growth in a preclinical model of colorectal cancer的文章。研究者发现RECTAS可诱导癌细胞中剪接相关新抗原的产生，以MHC I和CD8+ T细胞依赖的方式抑制肿瘤生长，通过转录组分析和免疫原性分析确定了6个候选的RECTAS诱导的剪接新抗原，并进一步验证了这些新抗原可诱导T细胞反应、杀死体外癌细胞及抑制体内肿瘤生长的作用。该研究提出了获得肿瘤新抗原的新方法，为基于新抗原疫苗的肿瘤免疫治疗提供了新策略。
研究结果
1、RECTAS具有CD8+ T细胞依赖性的抗肿瘤作用并增强PD-1阻断的效果
为了研究RECTAS是否具有抗肿瘤作用，研究者使用MC38荷瘤小鼠评估了其体内活性。在一定浓度下，RECTAS给药后的小鼠可以抑制体内肿瘤生长，延长生存期。分析提取的肿瘤组织后，发现经RECTAS给药后，肿瘤浸润CD8 + T细胞增加了1.5倍。而当使用CD8耗竭抗体(αCD8)耗尽内源性CD8+ T细胞时，RECTAS给药对肿瘤抑制无效。表明MC38肿瘤模型中RECTAS的抗肿瘤活性依赖于CD8+ T细胞介导的免疫反应。
肿瘤免疫原性与PD-1阻断的临床反应有关，作者进一步研究了RECTAS治疗是否增强抗PD-L1抗体(αPD-L1)的抗肿瘤作用。研究发现给药23天后，RECTAS和αPD-L1联合给药时，比二者单独给药的肿瘤抑制率的加和更高，这表明它们以一种添加剂或可能的协同作用发挥抗肿瘤作用，而在使用同型IgG、αPD-L1或αCD8治疗的小鼠中，无论是否使用RECTAS，体重均没有变化或明显的不良反应。这些结果表明，RECTAS诱导激活的SRSFS以CD8+ T细胞依赖的方式发挥抗肿瘤作用，并提高PD-1阻断的效果，但不直接对癌细胞产生细胞毒性或细胞抑制作用。
图| 化学激活SRSF以CD8+ T细胞依赖的方式发挥抗肿瘤作用及对PD-1阻断的增强响应
2、MHC I 在RECTAS的抗肿瘤作用中起着至关重要的作用
为了验证癌细胞中的新抗原呈递对RECTAS的抗肿瘤作用是否重要，作者使用MC38细胞建立了CRISPR-Cas9——敲除MHC I类的关键成分B2m(KO)。由此产生的B2m-KO MC38克隆(B2m KO #1和#2)表现出内源性B2m完全丧失，而不影响细胞增殖。将B2m KO MC38克隆接种到免疫活性小鼠中，评估RECTAS治疗的抗肿瘤效果，结果发现在B2m KO克隆中，RECTAS治疗不能抑制肿瘤生长且CD8+ T细胞的数量较低，这表明MHC I分子在决定RECTAS的抗肿瘤作用中起着至关重要的作用。
图| B2m KO MC38克隆接种的小鼠中多RECTAS治疗的抗肿瘤效果
3、RECTAS诱导的潜在剪接新抗原中鉴定出6个肿瘤新抗原并验证免疫原性
在确认MHC I类对于RECTAS的抗肿瘤作用至关重要后，研究者进一步猜测RECTAS治疗可能由于异常的pre-mRNA选择性剪接，产生剪接新抗原而发挥作用。为了验证这一猜想，研究者采用RNA-seq分析考察了RECTAS对MC38细胞中RNA剪接模式的影响并确定能与MHC I结合的潜在剪接产物新抗原。通过这种方法，研究者确定了130个基因的169个RECTAS诱导的未注释剪接产物作为潜在新抗原，并结合与MHC I 等位基因(H2-Kb和H2-Db)结合亲和力的预测、剪接率和mRNA表达范围，最终筛选出22个候选的RECTAS诱导的剪接新抗原(长度为8到11个氨基酸)用于后续评估。
图| 利用RNA-seq分析鉴定RECTAS诱导的剪接新抗原
为了验证22个候选剪接新抗原的免疫原性，研究者合成了这22个剪接新抗原和黑色素瘤抗原肽，以酪氨酸酶相关蛋白2 (TRP2)作为对照，接种于二次免疫小鼠，并使用IFN-γ酶联免疫斑点(ELISpot)法评估CD8+ T细胞的活性，最终鉴定了来自Kifc1、Nf1、Acbd4、Rfx7、Qpctl和Nup153的可变剪切并具有免疫原性的6个多肽。为了进一步验证这些新抗原是否广泛存在，研究采用Lewis肺癌、胰导管腺癌、WEHI3白血病、CT26结直肠腺癌、EG7淋巴瘤和B16黑素瘤细胞株的小鼠模型进行了研究，发现这些由RECTAS诱导的可变剪切在大多数的检测细胞中是共有的，这表明RECTAS适用于广泛的癌症。
图| 候选的剪接新抗原的体外验证
4、以这6个新抗原为疫苗，可有效诱导T细胞在体外杀伤MC38等癌细胞，并在MC38荷瘤小鼠中增强RECTAS介导的肿瘤抑制
为了探索6个新抗原对抗肿瘤免疫反应的影响，研究者将六价剪接新抗原和TRP2抗原接种于小鼠后制备脾细胞，在白细胞介素-2 (IL-2)存在的环境下，用BMDCs进一步刺激脾细胞，与抗原诱导效应细胞和CFSE荧光标记共培养24小时后，通过检测Annexin V+/ CFSE+细胞的个数来量化肿瘤杀灭活性，结果显示TRP2免疫小鼠的效应细胞没有表现出任何反应，而六价剪接新抗原刺激的效应细胞选择性地杀死了含有表位的MC38细胞，与此同时，在B2m KO MC38细胞中这种肿瘤杀伤活性不存在，表明这种效应是受MHC Ⅰ 依赖，诱导T细胞杀伤MC38癌细胞。进一步在三种癌细胞系模型小鼠(MC38， B16和LLC)中接种六价疫苗，分离出的效应细胞检测到MC38和LLC表现出细胞溶解活性。为进一步研究RECTAS诱导剪接新表位反应的T细胞是否可以抑制肿瘤生长，研究者对比了六价肽和六价肽+RECTAS的肿瘤抑制率，结果显示联合用药提高了肿瘤抑制率。这表明了RECTAS诱导剪接新抗原的六价疫苗充分诱导了内源性T细胞对肿瘤溶解的反应，同时癌细胞被RECTAS给药时，肿瘤的生长抑制作用增强。
图| 可变剪接的六价疫苗接种促进RECTAS诱导的抗肿瘤免疫应答
本文研究利用MC38肿瘤模型，证明了RECTAS的抗肿瘤效应是由肿瘤细胞中的CD8+T细胞和MHC I多肽介导的，并产生了可变剪接相关的新抗原。之后通过RNA-seq和体外IFN-γ ELISpot分析成功地筛选了6个RECTAS诱导的可变剪接新抗原并验证了免疫原性。在共培养实验中，六价疫苗充分诱导了内源性T细胞对肿瘤溶解的反应，RECTAS给药处理后可使体内肿瘤的生长受到抑制。文章表明RECTAS是一种安全且有前景的临床前候选药物，可用于癌症疫苗接种，并提供了将癌症免疫治疗与ICIs结合的新方法。
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